环境因素对心脏畸形胎儿影响的表观遗传学机制

摘要

心脏发育是一个高度复杂，时空协调的形态学发生过程，这个过程极易受外界环境干扰而导致心脏畸形的发生。80％的心脏畸形发生都有环境因素的参与。环境因素包括母亲孕期外界接触的环境，如有毒物质的侵袭;还包括母亲体内微环境改变如疾病状态，母亲孕期营养元素缺乏。另外，环境在参与塑造稳定的发育表型的同时，留下表观遗传学修饰标记，这种表观遗传学修饰是可遗传的，甚至在后代的发病过程中发挥一定的作用。因此我们推测胎儿心脏发育异常和表型改变与表观遗传学修饰改变有关，我们分别选择DNA甲基化修饰和microRNA作为我们研究心脏表观遗传学机制的载体，并从胎儿心脏异常发育和正常发育两方面对表观遗传学修饰这个议题进行剖析。
　　本课题中表观遗传学机制主要涉及DNA甲基化修饰和microRNA两方面，具体内容包括三部分，分别为:1）胎儿心脏畸形发生过程中DNA甲基化修饰的调控机制;2）孕期饮酒对胎鼠大脑、心脏组织以及胎盘组织印记基因甲基化状态的影响。3）胎儿心脏正常发育过程中microRNA的表达谱分析。
　　第一部分 胎儿心脏畸形发生过程中DNA甲基化修饰的改变
　　目的:研究心脏畸形胎儿心脏组织整体性甲基化状态改变，及心脏发育相关基因的甲基化状态与其表达的改变。
　　方法:共收集17例单纯心脏畸形、14例复杂畸形合并心脏畸形和22例正常胎儿心脏组织进行DNA抽提后亚硫酸氢盐处理，采用Roche NimbleGen's全基因组甲基化芯片检测5例心脏畸形（2例单纯性心脏畸形和3例非单纯性心脏畸形）和4例正常对照胎儿心脏，获得心脏畸形组织整体性甲基化水平改变情况;应用Sequenom MassARRAY EpiTYPER定量甲基化分析平台验证在15例单纯心脏畸形、11例非单纯心脏畸形与18例正常胎儿心脏组织中，10个心脏发育相关基因附近CpG位点的甲基化状态分析:抽提7例单纯性心脏畸形、7例正常胎儿心脏心脏组织总RNA抽提，反转录成cDNA，同时抽提其蛋白，分别应用定量real-time PCR和Westernblot检测EGFR、SMAD7、SLC19A1、NOTCH1在mRNA和蛋白水平的表达变化。
　　结果:心脏畸形胎儿心脏组织呈现整体性的低甲基化改变;在10个心脏发育相关基因附近甲基化位点中，心脏畸形（包括单纯性和非单纯性）胎儿心脏组织EGFR基因间、SMAD7基因内、SLC19A1基因间CpG sites的甲基化水平升高，而NOTCH1基因内CpG sites的甲基化水平降低;单纯性心脏畸形组织中EGFR基因mRNA水平表达有下降趋势，其编码蛋白表达下降，SMAD7基因mRNA水平有升高趋势，其编码蛋白表达升高，SLC19A1基因mRNA水平表达明显降低(p=0.007)，蛋白表达也降低，NOTCH1基因mRNA水平表达有降低趋势。
　　结论:心脏畸形胎儿心脏组织DNA甲基化水平的整体性降低和个别心脏发育相关基因CpG sites的甲基化水平改变及其基因表达的改变可能在心脏畸形的发生过程中发挥一定的调控作用。
　　第二部分 酒精暴露胎鼠心脏、大脑及胎盘组织印记基因Igf2/H19甲基化差异区域甲基化状态的分析及Igf2基因表达的改变
　　目的:研究酒精暴露对胎鼠心脏、大脑及胎盘印记基因Igf2/H19甲基化差异区域甲基化状态和Igf2基因表达的影响。
　　方法:酒精灌胃处理孕6.5天至15.5天孕鼠，Sequenom MassARRAYEpiTYPER平台检测孕16.5天胎鼠心脏、大脑及胎盘组织印记基因Igf2/H19四个DMRs（差异甲基化区域differential methylation regions）甲基化状态改变，定量RT-PCR检测Igf2基因mRNA水平的表达。
　　结果:酒精暴露胎鼠心脏Igf2/H19印记基因DMR1的甲基化水平有改变，Igf2基因表达降低;大脑Igf2/H19印记基因DMR2的甲基化水平有改变，Igf2基因表达明显升高;胎盘Igf2/H19印记基因H19 DMR甲基化水平有改变，Igf2基因mRNA水平表达也明显高于对照组。
　　结论:酒精暴露影响胎鼠心脏、大脑及胎盘印记基因Igf2/H19不同的DMR甲基化水平和Igf2基因的表达。
　　第三部分 胎儿正常心脏组织microRNA表达谱分析
　　目的:研究不同孕周胎儿心脏组织microRNA表达的时序性变化特点。
　　方法:收集5、7、9和23周龄正常胎儿心脏组织进行RNA抽提，应用AffymetrixmiRNA2.0芯片检测四个时间点microRNA的表达谱;Rlimma软件分析随孕周变化表达发生改变的microRNAs; cluster3.0软件聚类分析microRNA表达的不同变化趋势;GO(gene ontology)功能富集分析经网站预测microRNAs靶基因;定量real-time PCR验证芯片结果。
　　结果:胎儿期心脏组织microRNAs的表达呈现5个不同的变化趋势，大部分microRNAs被预测靶调控心脏发育相关因子的表达，参与心脏心腔、室间隔、流出道等解剖结构的形成，和心脏发育相关的重要信号通路调控。另有7个miRNAs在胎儿心脏组织中的表达变化得到验证。
　　结论:胎儿期心脏microRNA的表达呈现时间特异性，可能在心脏正常发育过程中发挥重要的作用。

目录

中英文缩写

摘要

前言

第一部分 胎儿心脏畸形发生过程中DNA甲基化修饰的改变

研究背景

材料和方法

结果

讨论

第二部分 酒精暴露对胎鼠心脏、大脑及胎盘印记基因Igf2/H19甲基化状态的影响及Igf2基因表达的改变

研究背景

材料和方法

结果

讨论

第三部分 胎儿正常心脏组织microRNA表达谱分析

研究背景

材料和方法

结果

讨论

总结与展望

参考文献

综述

致谢

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