微环境中肿瘤相关成纤维细胞介导的清热化湿中药抗胰腺癌作用研究

摘要

目的：
　　探讨清热化湿中药（清胰化积方，QYHJ）抗胰腺癌过程中肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的作用。
　　方法：
　　第一部分，
　　1.建立胰腺癌皮下移植瘤模型，分成QYHJ组和生理盐水对照组，评价QYHJ对胰腺癌生长的影响。
　　2.建立胰腺癌原位移植瘤模型，分成QYHJ组和生理盐水对照组，评价QYHJ对胰腺癌肝转移的影响。
　　第二部分，
　　1.家兔胃饲QYHJ获取含中药血清，并取正常家兔血清为对照组。56℃水浴锅，30分钟，制备灭活的中药血清及正常血清。
　　2.CCK-8法测定正常血清、正常灭活血清、中药血清、中药灭活血清对人胰腺癌细胞体外增殖的影响，并绘制细胞增殖曲线。
　　3.体外迁移及侵袭实验(Transwell)检测正常血清、正常灭活血清、中药血清、中药灭活血清对人胰腺癌细胞体外迁移及侵袭能力的影响。
　　第三部分，
　　1.采用原代培养的方法建立两对人胰腺正常成纤维细胞(NFs)及对应的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)。
　　2.采用免疫荧光(ICC)及Western-blot对原代培养成的成纤维细胞进行鉴定。
　　3.采用RT-PCR、Western-blot技术检测NFs、CAFs及经含药血清处理的CAFs之间CXCL1、2、8表达的差异。
　　4.CCK-8法测定含中药血清对CAFs体外增殖的影响。
　　5.采用免疫组化技术评价QYHJ干预后CAFs在小鼠移植瘤中增殖能力的变化。
　　6.采用免疫组化及Elisa技术评价CAFs表达、分泌CXCL1、2、8能力的改变。
　　第四部分，
　　1.体外迁移及侵袭实验(Transwell)检测CXCL1、2、8对人胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。
　　2.体外成球实验检测CXCL8/CXCR1对人胰腺癌细胞干性的影响。
　　3.流式细胞技术检测CXCL8/CXCR1对人胰腺癌干细胞比例的影响。
　　4.免疫组化法检测人体组织中CXCR1与干细胞标记物CD24/44/133的表达水平。
　　5.统计分析CXCR1及CD24/44/133之间表达水平的相关性。
　　6.统计临床资料分析CXCR1表达水平与胰腺癌患者临床特征之间的相关性。
　　7.单因素及多因素分析CXCR1表达水平与胰腺癌患者预后的关系。
　　第五部分，
　　体外迁移及侵袭实验(Transwell)检测NFs、CAFs及经含中药血清处理的CAFs上清对人胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。
　　结果：
　　第一部分，
　　在皮下移植瘤实验中，QYHJ组和Control组的成瘤率均达到100％。但Control组与QYHJ组之间肿瘤生长速度存在差异，中药组经过QYHJ干预后肿瘤的生长速度低于Control组，从QYHJ干预第15天开始两组之间肿瘤的生长速度就出现了明显差异(P＜0.05)。第21天处死裸鼠，发现QYHJ组平均瘤重小于Control组，Control组和QYHJ组的瘤重分别为0.705±0.198809g、0.435429±0.151751g，抑瘤率为38.24％(P＜0.05)。在原位移植瘤实验中，QYHJ组原位移植瘤的体积明显小于对照组，并且QYHJ组小鼠肝脏转移灶的数目(P=0.042)及转移率(P=0.002)也明显少于对照组。提示QYHJ可以有效地抑制胰腺癌的增殖及转移。
　　第二部分，
　　四组血清对人胰腺癌细胞系增殖、迁移及侵袭的抑制能力有显著差异，从高到低分别为中药组、正常、中药灭活组、正常灭活组。正常组高于正常灭活组，这可能和机体在正常情况下的免疫反应有关。中药灭活组高于正常灭活组，这可能和中药有效成分本身对于胰腺癌细胞的直接作用有关。中药组高于中药灭活组，提示中药抗胰腺癌存在间接作用，且这部分间接作用能够有效地抑制胰腺癌的恶性潜能。
　　第三部分，
　　经过原代培养建立起两对（＃1，＃2）相应的NFs和CAFs细胞，并选取上皮细胞标记物人广谱细胞角蛋白(Pan Cytokeration[AE1/AE3]，CK)、E-cadherin，间质标记物Vimentin及CAFs特异性标记物α-SMA，通过免疫荧光(ICC)和Western-blot的方法对其进行鉴定。结果显示NFs和CAFs都不表达上皮细胞标记物CK及E-cadherin，但都表达间质标记物Vimentin，CAFs还高表达其特异指标α-SMA。提示我们成功建立起人胰腺NFs及胰腺癌CAFs。
　　我们进一步检测了成纤维细胞分泌的CXCL家族的几个因子的表达。结果显示CXCL1、2、8在CAFs中的表达明显高于NFs，且在用QYHJ干预后CAFs中的CXCL1、2、8表达明显下调。体内免疫组化的结果也提示QYHJ组中CXCL1、2、8的阳性率明显降低，进一步检测小鼠血清中CXCLs的含量，发现它们在Control和QYHJ组中含量分别为57.49±5.07pg/L VS43.27±7.01pg/L(P＜0.05);42.88±4.00 pg/L VS33.92±1.42pg/L(P＜0.05);343.03±50.68 pg/L VS190.52±39.36 pg/L(P＜0.05)。同时我们也观察了QYHJ对CAFs增殖的影响，体外增殖实验中QYHJ组OD值明显低于Control组，体内的免疫组化结果提示QYHJ干预后Vimentin和α-SMA表达明显下降，提示QYHJ能抑制CAFs的增殖。
　　第四部分，
　　在迁移和侵袭实验当中CXCL1、2、8干预组中Capan1细胞的穿过数量都高于对照组和抑制剂组(P＜0.05)。成球实验中CXCL8组中干细胞球的数量明显多于对照组(P=0.000)，在加入抑制剂后CXCL8诱导的干细胞成球能力受到抑制(P=0.002)。在CXCL8诱导后Capan1干细胞比例明显高于对照组(P=0.002)和抑制剂组(P=0.03)。
　　临床资料的分析结果显示CXCR1和胰腺癌干细胞标记物CD44/133表达呈正相关，并且和胰腺癌淋巴结转移关系密切。同时CXCR1、CD44/133也和胰腺癌患者的预后相关，CXCR1是胰腺癌患者预后的一个独立相关因素。
　　第五部分，
　　NFs组及QYHJ干预后的CAFs条件培养基组比CAFs条件培养基组Capan1细胞穿透数量更少(P＜0.05)。
　　结论：
　　QYHJ可以有效地抑制胰腺癌细胞的增殖及远处转移，它的这种作用除了本身有效成分之外，还存在间接作用，其中的一个间接靶点在于CAFs。QYHJ可以通过抑制CAFs的增殖以及抑制CAFs分泌CXCL1、2、8间接地达到抗胰腺癌的作用。这种作用主要包括两个方面，胰腺癌细胞的迁移、侵袭以及胰腺癌细胞的干性。

目录

主要缩略词表

摘要

前言

参考文献

第一部分：中药抑制胰腺癌移植瘤生长及转移实验研究

材料与方法

四、结果

五、讨论

结语

参考文献

第二部分：中药直接/间接抑瘤作用初探

材料与方法

四、结果

五、讨论

结语

参考文献

第三部分 中药对肿瘤相关成纤维细胞增殖及其来源的CXCL家族趋化因子表达及分泌的影响研究

材料与方法

四、结果

五、讨论

结语

参考文献

第四部分 肿瘤相关成纤维细胞来源的CXCL家族趋化因子对胰腺癌细胞恶性表型的影响研究

材料与方法

四、结果

五、讨论

结语

参考文献

第五部分 肿瘤相关成纤维细胞介导的中药在胰腺癌转移、侵袭的研究

材料与方法

四、结果

五、讨论

结语

参考文献

综述一 胰腺癌的中医治疗进展

综述二 肿瘤相关成纤维细胞研究进展

在读期间发表论文

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致谢

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