柠檬酸裂酶的乙酰化调控及其在肺癌中的作用和分子机制

摘要

蛋白质乙酰化是一种重要的蛋白翻译后修饰，由于其在生命活动中的重要作用受到日益关注。我们和其他的实验室用质谱鉴定的方法，发现了很多核外蛋白质存在乙酰化修饰。值得一提的是，几乎所有的细胞代谢循环中的代谢酶，均存在不同程度的乙酰化调控。此外研究表明肿瘤的发生发展与细胞代谢的异常密不可分。我们的研究工作旨在通过对肿瘤代谢途径中关键酶的研究，阐述代谢酶的乙酰化修饰在肿瘤生长增殖调控中的作用，从而为肿瘤学的研究提供理论支持，为以后的临床肿瘤治疗提供新的理论基础。
　　为了进一步阐明蛋白质的乙酰化修饰与肿瘤细胞的发生发展的关系，我们选取了细胞脂肪酸合成代谢中的重要代谢酶柠檬酸裂酶(ACLY)作为研究对象，深入研究乙酰化修饰对蛋白稳定性调控及其在肿瘤细胞代谢的重要作用。通过大量系统性的实验，我们发现以下几点重要内容:
　　一、细胞内能量水平调节ACLY的乙酰化和泛素化。我们发现高糖促进ACLY的乙酰化，进而保护其不受蛋白酶体降解，导致ACLY的稳定性增加。其次，ACLY的乙酰化修饰还可以提高其自身的酶催化活力，从而更进一步的促进其行使细胞学功能。
　　二、ACLY三个重要的乙酰化调控位点为K540，K546和K554。突变上述三个乙酰化位点后我们发现ACLY的泛素化水平有显著降低。通过免疫学方法，我们成功制备了识别这三个位点乙酰化水平的ACLY内源抗体，并用实验证明明细胞的能量状态，特别是细胞内葡萄糖水平，可以显著促进ACLY的K540，K546和K554乙酰化水平，从而调控其蛋白的稳定性。
　　三、PCAF和SIRT2分别是ACLY的乙酰化酶和去乙酰化酶。，高葡萄糖增强PCAF与ACLY的相互作用，导致ACLY的乙酰化，保护其不受降解，增加其蛋白的稳定性;SIRT2是ACLY的去乙酰化酶，在低葡萄糖情况下，降低ACLY的乙酰化水平，从而促进其泛素化降解。
　　四、我们以人非小细胞肺癌模式细胞A549为研究材料，成功构建了表达水平与内源相当的ACLY的乙酰化突变体(3KQ，3KR)稳定细胞株。通过对细胞生长计数、外源脂类的吸收以及裸鼠成瘤实验表明，ACLY的乙酰化通过增加脂肪酸的合成来促进肿瘤细胞和肿瘤移植物的生长。
　　五、ACLY乙酰化修饰与肺癌的发生发展密切相关。在对比55对癌与癌旁的临床肺癌样品后我们发现，有大约50％的样品存在ACLY蛋白水平上调，而这其中又有大于50％的样品中检测到了上调的ACLY乙酰化水平，从而证明了ACLY的乙酰化修饰在肺癌发生发展中的重要性。
　　本论文所报道的新发现在于:首次报道了ACLY的乙酰化和泛素化串话，阐明了其应对细胞能量水平的分子机制及其在肺癌发生中的作用。我们的研究不仅为乙酰化的后续研究提供详尽的理论基础，更为肿瘤代谢相关疾病，特别肺癌的治疗提供了潜在的药物靶点。

目录

缩略词表

摘要

第一章 引言

1．蛋白质的翻译后修饰

2．蛋白质乙酰化修饰的研究与进展

2．1 组蛋白的乙酰化修饰

2．2 乙酰基转移酶和去乙酰基转移酶

2．3 非组蛋白的乙酰化修饰

2．4 蛋白质乙酰化修饰和其它翻译后修饰的交叉互作

3．肿瘤代谢的特点与研究进展

3．1 肿瘤细胞代谢与“温伯格效应”

3．2 蛋白翻译后修饰与肿瘤

3．3 脂肪酸代谢在肿瘤细胞发生发展中的作用

4．本文主要的研究内容、目的、意义和其创新点

第二章 乙酰化对柠檬酸裂酶(ACLY)的调控

1．研究背景

1．1 脂肪酸合成代谢

1．2 ACLY的功能研究进展

2．材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．2 实验步骤与方法学

3．结果与分析

3．1 ACLY存在乙酰化修饰

3．2 ACLY的乙酰化受细胞内能量水平的调控

3．3 ACLY的乙酰化修饰增强其蛋白水平

3．4 ACLY的乙酰化促进其自身酶活，且不影响其聚合

3．5 ACLY的乙酰化保护其不受泛素化降解

4．本章小结

第三章 柠檬酸裂酶(ACLY)的泛素化研究

1．研究背景

2．材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．2 实验步骤与方法学

3．结果与分析

3．1 UBR4泛素连接酶的部分缺失影响ACLY的蛋白水平

3．2 ACLY与UBR4泛素连接酶剪接体的相互作用

3．3 ACLY与UBR4泛素连接酶剪接体的互作与细胞内葡萄糖水平相关

4．本章小结

第四章 柠檬酸裂酶(ACLY)乙酰化酶与去乙酰化酶的鉴定

1．研究背景

1．1 PCAF的重要功能

1．2 SIRT2的重要功能

2．材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．2 实验步骤与方法学

3．结果与分析

3．1 PCAF是ACLY的乙酰基转移酶

3．2 PCAF与ACLY的相互作用受细胞能量水平调控

3．3 PCAF减少ACLY的蛋白水平并降低其稳定性

3．4 SIRT2是ACLY的去乙酰化酶

3．5 抑制SIRT2的活性可以稳定ACLY并提高其蛋白水平

3．6 SIRT2与ACLY的相互作用受细胞能量水平调控

4．本章小结

第五章 柠檬酸裂酶(ACLY)的乙酰化在肿瘤细胞的生长代谢中发挥重要功能

1．研究背景

2．材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．2 实验步骤与方法学

3．结果与分析

3．1 ACLY的乙酰化促进肿瘤细胞的生长

3．2 ACLY的乙酰化促进肿瘤细胞的脂肪酸合成，降低其对外源脂的吸收

3．3 ACLY的乙酰化促进肿瘤细胞的脂肪酸合成，降低其对外源脂的吸收

3．4 ACLY的乙酰化促进裸鼠异植瘤的生长和增殖

4．本章小结

第六章 柠檬酸裂酶(ACLY)的乙酰化水平在人肺癌(HLC)临床样本中的鉴定与统计分析

1．研究背景

2．材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3．结果与分析

3．1 ACLY的蛋白量在人肺癌临床样品中存在显著上调

3．2 ACLY的乙酰化水平在其蛋白量增加的人肺癌临床样品中显著上调

4．本章小结

讨论

葡萄糖水平决定的乙酰化修饰调控脂肪酸合成途径

翻译后修饰的交叉互作在细胞代谢中的重要作用

乙酰化对肿瘤生长增殖的调控机制探讨

总结

参考文献

后记

致谢

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