核苷酸剪切修复基因单核苷酸多态性与胃癌遗传易感性的分子流行病学研究

摘要

背景与目的:胃癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，世界范围内胃癌的新发病人数约为99.0万人，仅次于肺癌、乳腺癌与结直肠癌;死亡人数约为73.4万人，仅次于肺癌。胃癌的发生是多因素参与、多基因变异及多阶段逐步发生的过程。除环境因素外，基因组DNA的稳定性在肿瘤的发生中发挥着重要的作用。DNA损伤修复能力的强弱是维持基因组DNA稳定性以及细胞正常功能的重要环节，一旦修复基因发生改变（体突变以及遗传多态性变化），就会对整个基因组DNA的修复能力产生影响，当机体不能够及时修复损伤的DNA，以致损伤积累到一定程度就会导致基因组DNA不稳定性大大提高，从而引起细胞增殖和分化异常，最终导致肿瘤的发生。中国胃癌的发病率以及死亡率远高于国外，但与其病因有关的核苷酸剪切修复(NER)通路核心基因的研究相对不足，已有的研究主要集中于引起氨基酸改变的个别位点的研究，而对于功能性位点的研究甚少;再者，已发表研究中的样本数量少且单个研究中所包括的病人及对照的数目也相对较小，缺乏系统性的基于整个NER通路的大样本的研究。因此，本研究采用大样本旨在探讨NER通路核心基因潜在功能性位点单核苷酸多态性与胃癌的遗传易感性的关系，为胃癌的早期诊断和治疗提供科学依据。
　　方法:我们对NER通路核心基因16个潜在功能性位点在1125例胃癌病人及1196例健康对照中运用TaqMan探针法进行基因分型，利用HapMap数据库中270个正常人的基因型数据以及相应的mRNA表达数据对所发现阳性位点进行基于基因型的mRNA表达分析，并对基因3'端阳性位点构建双荧光报告质粒与miRNA共转染进行细胞水平的功能分析。采用卡方检验比较人口学特征、吸烟及饮酒状况、肿瘤部位、肿瘤分期以及NER通路核心基因各基因型在病例及对照中的分布差异;应用单因素和多因素logistic回归分析计算比值比(OR)及95％置信区间(CI)及独立样本t检验计算不同基因型的mRNA表达差异及荧光素酶活力差异;我们还采用异质性检验计算样本是否存在取样偏倚及假阳性报道预测评估结果的假阳性率并采用多因子降维法分析交互作用等方法对所得数据进行统计分析。
　　结果:我们所得到的结果如下:
　　1、所选ERCC1基因3个多态性位点单个位点分析表明rs2298881C＞A以及rs11615G＞A多态性位点在病例组及对照组中存在着显著的统计学差异（P值分别为0.037及0.0496）。多因素Logistic回归分析显示，与携带rs2298881AA基因型的个体相比，rs2298881AC基因型携带者个体患病风险增加了37％(校正OR=1.37，95％ CI=1.08-1.74); rs2298881CC基因型携带者个体患病风险增加了26％（校正OR=1.26，95％ CI=0.98-1.63）;rs2298881AC/CC基因型携带者个体患病风险增加了33％（校正OR=1.33，95％ CI=1.05-1.67）。而与携带rs11615GG基因型的个体相比，rs11615AG基因型携带者个体患病风险增加了25％(校正OR=1.25，95％ CI=1.05-1.48); rs11615AA基因型携带者个体患病风险增加了13％（校正OR=1.13，95％ CI=0.78-1.63）;rs11615AG/AA基因型携带者个体患病风险增加了23％（校正OR=1.23，95％ CI=1.05-1.46）。在与拥有0-1个ERCC1基因双倍型者相比，拥有2-3个危险双倍型的个体患病风险增加了56％(校正OR=1.56,95％ CI=1.27-1.93)。
　　进一步分层分析显示，对于rs2298881AA基因型来说，rs2298881AC/CC基因型者在女性、现吸烟者、不饮酒者、非贲门腺癌患者及早期患者中具有更显著的危险性。对于rs11615GG基因型来说，rs2298881AG/AA基因型者在年轻者、女性、现吸烟者、饮酒者、非贲门腺癌患者及早期患者中具有更显著的危险性。而对于拥有0-1个危险双倍型个体来说，2-3个危险双倍型者在年长者、女性、现吸烟者、饮酒者、非贲门腺癌患者及早期患者中具有更显著的危险性。
　　根据所选ERCC1所选的3个SNP位点进行联合分析，与最常见的CCG单倍型相比，ACG单倍型在胃癌患者中明显少于正常对照(校正OR=0.72,95％ CI=0.61-0.86)。这与前面rs2298881C＞A在病例及对照中的风险是一致的。
　　我们对前面发现的阳性结果进行假阳性报道预测，发现在设定假阳性报道预测值为0.2，先验概率为0.01条件下，与拥有0-1个危险双倍型个体相比，2-3个危险双倍型的阳性结果仍然可信（FPRP值=0.007）。在该分层分析下非饮酒者，胃非贲门腺癌以及早期患者的阳性结果可信。此外，与最常见的CCG单倍型相比，发现的ACG在胃癌患者中明显低于正常对照也是可信的。
　　在中国人群中，相对于rs2298881AA基因型携带者来说，rs2298881CC基因型携带者ERCC1基因的mRNA表达量明显升高(P=0.006)，rs2298881AC/CC基因型携带者的mRNA表达量也是明显升高的（P=0.006），且从AA-AC-CC有明显的累积效应（Ptrend=0.003）。对于含有四种人的总人群来说，rs2298881CC基因型携带者mRNA表达量也是明显升高(P=0.001)，rs2298881AC/CC基因型携带者的mRNA表达量也是明显升高的(P=0.004)，且从AA-AC-CC有明显的累积效应（Ptrend＜0.0001）。而对于rs11615多态性位点，在中国人群以及总人群中未发现突变型AA相对于野生型GG有显著的表达量的改变。
　　2、所选XPC基因2个SNP位点单个位点分析表明，仅rs1870134G＞C在病例组及对照组中存在着显著的统计学差异（P值为0.009）。多因素Logistic回归分析显示，与携带rs1870134GG基因型的个体相比，rs1870134CG基因型携带者个体患病风险降低了20％（校正OR=0.80，95％ CI=0.68-0.95）;rs1870134CC基因型携带者个体患病风险降低了30％（校正OR=0.70，95％ CI=0.50-0.97）;rs1870134CG/CC基因型携带者个体患病风险降低了21％(校正OR=0.79，95％CI=0.67-0.93)。在与拥有0-1个XPC基因危险双倍型者相比，拥有2个危险双倍型的个体患病风险降低了21％（校正OR=0.79，95％ CI=0.67-0.93）。
　　进一步分层分析表明，对于rs2228001GG基因型来说，rs2228001TG/TT基因型者在饮酒者、非贲门腺癌患者中具有显著的保护作用。对于rs1870134GG基因型来说，rs1870134CG/CC基因型者在年轻者、男性、非吸烟者、非饮酒者、非贲门腺癌患者及中晚期患者中具有更显著的保护作用。而与拥有0-1个危险双倍型个体相比，拥有2个危险双倍型者结果与rs1870134者类似。
　　根据所选XPC基因的2个SNP位点进行联合分析，与最常见的TG单倍型相比，GG单倍型在胃癌患者中明显多于正常对照，其胃癌发病风险增加了15％（校正OR=1.15，95％CI=1.00-1.33）。
　　我们对XPC基因所发现的阳性结果进行假阳性报道预测，发现在设定假阳性报道预测值为0.2，先验概率为0.01条件下，在分层分析中与GG基因型携带者个体相比，CG/CC基因型携带者在年青者，胃非贲门腺癌以及中晚期患者的阳性结果可信。在分层分析中与拥有0-1个危险双倍型个体相比，2个危险双倍型的阳性结果在年轻者，胃非贲门腺癌以及早期患者的阳性结果可信。
　　针对XPC基因的阳性位点rs1870134进行基于基因型的mRNA表达分析，发现在中国汉族人群中rs1870134CC基因型携带者XPC基因mRNA表达水平明显低于rs1870134GG基因型携带者(P=0.026)。在含有所有人的人群中，当rs1870134GG基因型携带者mRNA表达量作为对照时，rs1870134CG基因型携带者mRNA表达量显著降低(P=0.0002);rs1870134CC基因型携带者mRNA表达量亦显著降低(P=0.010);rs1870134CG/CC基因型携带者mRNA表达量也明显降低(P＜0.0001)。
　　3、所选XPD基因4个SNP位点的多态性与胃癌发病风险均无显著性关联。
　　4、所选XPF基因2个SNP位点在病例组及对照组比较中均无显著的统计学差异。然而，与最常见的CA单倍型相比，GA单倍型携带者胃癌发病风险增加了19％（校正OR=1.19，95％CI=1.01-1.40）。
　　5、所选XPG基因5个SNP位点单个位点分析表明，在所选五个SNP位点中仅rs873601G＞A在病例组及对照组中存在着显著的统计学差异，尤其是在隐性遗传模型下（P值为0.032）。多因素Logistic回归分析显示，rs873601G＞A的位点变异与胃癌的发病风险呈正相关。与携带rs873601GG基因型的个体相比，rs873601AG基因型携带者个体患病风险增加了8％(校正OR=1.08，95％ CI=0.89-1.32); rs873601AA基因型携带者个体患病风险增加了30％(校正OR=1.30，95％ CI=1.03-1.64);在隐性模型下与rs873601GG/AG基因型携带者相比，rs873601AA基因型携带者个体患病风险增加了23％(校正OR=1.23，95％CI=1.01-1.49)。在与拥有0-2个XPG基因危险双倍型者相比，拥有3-4个危险双倍型的个体患病风险增加了25％（校正OR=1.25，95％ CI=1.04-1.51）。
　　进一步分层分析表明，当rs873601GG/AG作为对照基因型时，rs873601AA基因型者在年长组、男性、吸烟者、非贲门腺癌患者及早期患者中具有显著的危险作用。
　　假阳性报道预测分析发现，在设定假阳性报道预测值为0.2，先验概率为0.1条件下，与rs873601GG基因型携带者相比，rs873601AA基因型可提高胃癌发病风险仍然可信（FPRP值=0.159）;在隐性模型下，仅年长组阳性结果仍然可信。在0-2个危险双倍型为对照下，拥有3-4个危险双倍型的阳性结果可信;对其进行分层分析时男性、胃非贲门腺癌以及早期患者的阳性结果可信。
　　我们还针对XPG基因的阳性位点rs873601进行基于基因型的mRNA表达分析，发现当rs873601GG基因型携带者mRNA表达量作为对照时，在中国汉族人群中rs873601AA基因型携带者XPG基因mRNA表达水平明显降低(P=0.011)。在其它三种人群中该现象不明显，而在含有所有人的人群中，rs873601AA基因型携带者mRNA表达量也是显著降低(P=0.002);rs873601AG/AA基因型携带者mRNA表达量亦显著降低（P=0.029）。在对所选的141例胃癌癌旁正常组织mRNA进行检测发现rs873601AA与rs873601GG基因型携带者mRNA表达存在一定的差异(P=0.096)，但尚未达到显著性。
　　将含有psiCHECK2∶rs873601AA、psiCHECK2∶rs873601GG及阴性对照的质粒与has-miR-1227进行转染，rs873601GG基因型的荧光素酶活力明显低于rs873601AA基因型者，在所有四株细胞中均差异明显:HeLa细胞株(P=4.85×10-6)，A549细胞株（P=0.002），N45细胞株(P=0.007)及7901细胞株(3.98×10-4)。
　　我们对所发现的4个有意义位点进行类似于单倍型的联合分析，发现与具有保护作用的AGCG单倍型携带者相比，AGCA单倍型携带者在胃癌患者中明显多于正常对照，其胃癌发病风险增加了40％(校正OR=1.40，95％ CI=1.02-1.93); AGGG单倍型携带者其胃癌发病风险增加了38％(校正OR=1.38，95％ CI=1.10-1.72); CGGA单倍型携带者其胃癌发病风险也增加了38％(校正OR=1.38，95％ CI=1.10-1.72); CAGA单倍型携带者其胃癌发病风险增加了53％(校正OR=1.53，95％CI=1.22-1.92)。
　　我们采用多因子降维法对所发现的四个有意义位点以及与之相关的在病人及正常对照中均存在的可能危险因素进行联合分析，发现在单一因素下吸烟状态对胃癌的发生发挥着重要的作用，其符核效度为100/100，平均预测错误为45.2％;在三个因素下吸烟、年龄以及rs1870134G＞C多态性为最佳交互作用模型，其符核效度为100/100，平均预测错误为42.9％;而将所有因素以及基因型结合起来时其符核效度为100/100，平均预测错误为39.0％。
　　结论:NER通路ERCC1基因rs2298881C＞A、rs11615G＞A，XPC基因rs1870134G＞C以及XPG基因rs873601G＞A位点的多态性改变可能与中国人群胃癌的遗传易感性相关，此结果有待于精心设计的更大规模不同种族人群的前瞻性研究来进行验证。

目录

摘要

前言

研究对象与方法

(一)研究对象

(二)仪器和试剂

(三)主要实验方法及操作步骤

(四)统计分析

研究结果

一、研究病例及对照的一般特征

二、NER通路核心基因多态性位点与胃癌遗传易感性

(一)ERCC1基因多态性与胃癌遗传易感性

(二)XPC基因多态性与胃癌遗传易感性

(三)XPD基因多态性与胃癌遗传易感性

(四)XPF基因多态性与胃癌遗传易感性

(五)XPG基因多态性与胃癌遗传易感性

三、基于NER通路核心基因阳性位点基因型的mRNA表达分析

四、XPG基因miRNA结合位点rs873601G>A功能验证

五、基于NER通路所发现有意义位点的危险单倍型联合分析

六、交互作用分析

分析与讨论

参考文献

附录一 主要缩略词中英文对照

附录二 综述 胃癌分子流行病学研究进展

附录三 发表文章

个人简历

致谢

声明