小分子糖类对人红细胞的冰冻干燥保护研究

摘要

冰冻干燥(冻干)保存人红细胞在临床输血和战伤救治方面具有重要意义。目前临床上主要的红细胞保存方法有4℃冷藏和-80℃深低温保存。这些保存方法都有很好的效果，但又存在明显不足：4℃保存时间短，而且容易受到污染；-80℃保存可以将保存时间延长至10年以上，但需要笨重的超低温冰箱等专门储存设备，而且解冻后需要复杂的洗涤程序以去除甘油。对比之下，冻干保存的红细胞具有以下优势：便于室温保存，重量大大减轻，方便运输等。 然而红细胞冻干保存并非易事，研究发现冻干后红细胞血红蛋白严重外漏，其主要原因是干燥过程对细胞膜产生严重损伤。有研究表明海藻糖能够提高细胞膜的耐干燥性。本实验以此为切入点，以小分子糖类(海藻糖和葡萄糖)和大分子物质作为主要保护剂进行人红细胞的冻干保存研究，为红细胞冻干保存的深入研究奠定基础。首先进行红细胞对海藻糖和葡萄糖吸收规律以及糖类吸收过程对红细胞结构和理化性质影响的研究，在简单扩散基础上，采用膜内外渗透压差异和磷脂相变结合的方法将小分子糖类导入细胞内。其次，采用葡萄糖、海藻糖、人血白蛋白和PVP作为主要保护剂对红细胞冻干保存的可行性进行了研究，并对冻干条件，如保护剂浓度、玻璃化程度、预冻温度、搁板温度以及再水化条件进行了优化筛选。 结果表明：1．红细胞对糖类的吸收存在一定的规律性，即随着细胞外液糖浓度的增加、孵育温度的上升以及孵育时间的延长，红细胞对糖类的吸收效率呈上升的趋势；红细胞对葡萄糖的吸收效率明显高于海藻糖。另外在相同9呼育条件下，海藻糖对红细胞溶血率和变形性造成的损伤明显高于葡萄糖，然而海藻糖维持PS非对称性分布和提高红细胞渗透耐受性的能力显著高于葡萄糖；另外海藻糖保护膜磷脂过氧化损伤的能力也要高于葡萄糖；在葡萄糖缓冲液中添加一定浓度的海藻糖，可以显著提高红细胞的渗透压耐受性、维持红细胞膜PS非对称性分布以及减少膜脂质过氧化损伤，同时葡萄糖在一定程度上也缓解了海藻糖对红细胞溶血率的不利影响。在葡萄糖引起的红细胞凋亡过程中，胱门蛋白酶一3和胱门蛋白酶-8没有活化，而亮抑酶肽却可以很好地抑制红细胞PS外翻。2．冻干红细胞保护液的筛选过程中，将海藻糖和葡萄糖导入红细胞可以显著降低冻干保存红细胞再水化后的溶血率，而且可以减少红细胞代谢功能的损失；DSC分析结果表明，随着保护液中PVP浓度的升高，红细胞的结晶起始温度随之下降，这表明保护液的玻璃化程度呈上升的趋势。然而随着玻璃化程度的升高，再水化后红细胞溶血率呈先下降后上升的趋势，这表明过高的玻璃化程度可能不利于红细胞的冻干保存；另外在保护液中添加人血白蛋白也可以对冻干红细胞提供保护作用。3．对冻干程序的研究表明，过低的预冻温度可以造成溶血率的增加，这主要是由于预冻过程中二次复温对红细胞造成冰晶损伤。当搁板温度低于-30℃时，再水化后红细胞溶血率在20％左右，各组之间差异不显著。4．再水化液中添加低浓度的大分子物质有利于再水化后红细胞的存活，而且较高的再水化温度也可以显著降低再水化后红细胞的溶血率。5．电镜观察结果表明再水化后80％的红细胞保持膜完整，但是仍有一些细胞呈棘形，而且也有部分红细胞发生血红蛋白泄漏。 综上所述，通过本研究初步证明将小分子糖类和大分子物质作为主要保护剂冻干保存人红细胞是可行的。海藻糖在细胞的干燥保存方面具有不可比拟的优势，但是由于红细胞自身结构功能的特点从而导致海藻糖吸收过程中红细胞损伤的增加，而这些损伤直接导致冻干一再水化后红细胞损伤的增加，将海藻糖和葡萄糖结合起来，不但可以提高细胞内海藻糖和葡萄糖的浓度，而且海藻糖可以提高红细胞的渗透压耐受性、减少PS外翻和质膜过氧化损伤。下一步工作将集中于寻求一种安全有效的糖类导入方法，并对冻干过程对红细胞超微结构的损伤进行深入研究。

目录

论文说明：英文缩略语

声明

摘要

前 言

第一部分人红细胞对小分子糖类吸收规律研究

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分人红细胞冰冻干燥保存研究

材料和方法

结 果

讨论

总结

参考文献

总 结

致 谢

博士生学习期间已发表和待发表的论文

发表论文一

发表论文二

发表论文三