检测斑疹伤寒病原体实时荧光定量PCR方法的建立黑龙江立克次体和立克次体精河株毒力和抗原性初步研究

摘要

第一部分检测斑疹伤寒病原体的实时荧光定量PCR方法建立 斑疹伤寒病原体包括普氏立克次体和莫氏立克次体，本研究采用实时荧光定量PCR TaqM MGB探针技术，根据两者的外膜蛋白B基因序列(ompB)分别设计一对种特异性引物与一个种特异性探针，建立了检测斑疹伤寒病原体——普氏立克次体、莫氏立克次体的两种实时荧光定量PCR。 用这两种荧光定量PCR分别检测两种斑疹伤寒病原体的标准目的DNA，最低检出量小于10个拷贝，检出灵敏度约为普通PCR的1000倍；用两种方法分别检测其它立克次体和相关的病原菌DNA样本，检出结果均为阴性。 用这两种定量PCR方法分别检测普氏立克次体和莫氏立克次体感染豚鼠血样本，从感染第3天到第18天的大部分血样本检测为阳性，而用相应的普通PCR检测血样本，结果均为阴性。用一种定量PCR方法检测另一种定量PCR方法检出的阳性样本，检测结果均为阴性。 本研究建立的检测两种斑疹伤寒病原体的实时荧光定量PCR方法具有高度种特异性和敏感性，适合于快速检测斑疹伤寒感染早期血样本中微量立克次体DNA，快速确诊流行性斑疹伤寒和地方性斑疹伤寒。 第二部分黑龙江立克次体和立克次体精河株的毒力与抗原性初步研究 斑点热(spotted fever)是由斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsiae，SFGR)所引起的一组疾病的总称。本研究采用斑点热群特异性实时荧光定量PCR，以经典的斑点热病原体——立氏立克次体R株为参照，对我国分离的黑龙江立克次体和立克次体精河株的毒力和抗原性进行了初步的比较研究。 黑龙江立克次体和立克次体精河株与立氏立克次体一样可生长、繁殖在Vero细胞胞质内，电镜观察显示两者的形态、结构与立氏立克次体非常相似。 用相同浓度的立克次体细胞培养物分别感染小鼠和豚鼠，在感染后2-3天豚鼠的体温开始升高，在7天左右豚鼠的发热达高峰，体温测量结果显示立氏立克次体感染豚鼠发热的体温峰值和15天平均体温最高，立克次体精河株感染豚鼠次之，黑龙江立克次体最低。 用荧光定量PCR的方法检测立克次体感染小鼠脏器标本，检测结果显示立氏立克次体在小鼠肝、脾中的繁殖量显著高于立克次体精河株和黑龙江立克次体，显示立氏立克次体的高毒力。但是在感染早期，立克次体精河株在小鼠肺部的繁殖量却显著高于立氏立克次体，其嗜肺细胞的特性值得注意。 用间接免疫荧光法检测3种立克次体感染血清和作它们的血清交叉反应，结果显示交叉反应特异性抗体滴度比同源反应特异性抗体滴度低4倍以上，提示3者均既具有群特异抗原又具有独特种特异抗原，可以诱导产生高水平的种特异性抗体。

目录

声明

第一部分中文摘要

第一部分英文摘要

第二部分中文摘要

第二部分英文摘要

第一部分 检测斑疹伤寒病原体的实时荧光定量PCR方法建立

绪 论

1材料

2方法

3结果

4讨论

结 论

参考文献

第二部分 黑龙江立克次体和立克次体精河株的毒力与抗原性初步研究

绪论

1材料

2方法

3结果

4讨论

结 论

参考文献

实验研究 实时荧光定量PCR检测普氏立克次体

附录

致谢