TLR4信号途径对肝星状细胞基因表达网络的调节作用以及对肝星状细胞—肝癌细胞间相互作用的影响

摘要

第一部分 Toll样受体4信号途径对肝星状细胞基因表达网络的调节作用
　　目的:研究Toll样受体4(TLR4)信号途径对肝星状细胞(HSC)基因表达网络的影响，以进一步明晰TLR4信号在HSC生物学特性中所起的作用。
　　方法:采用高通量全基因组mRNA表达谱芯片的方法，检测野生型(JS1)和TLR4基因敲除型(JS2)小鼠肝星状细胞株在基础及TLR4外源性病原模式配体内毒素(LPS)和内源性损伤模式配体高迁移率族蛋白B1(HMGB1)刺激下的基因表达谱;采用limma算法筛选差异基因;Fisher检验对差异基因进行功能显著性分析(GO-Analysis)得到差异基因所显著影响的功能;采用Fisher精确检验进行差异基因信号传导通路的显著性分析(Pathway-Analysis)，并对多重假设检验的结果进行校正和获得误判率(FDR);以显著性Pathway中所参与的基因为研究对象，基于KEGG数据库的基因间相互作用关系网络进行整合，得到差异基因间的相互作用关系网络(Gene-Act-Net)，获得差异基因构成的信号转导流程以及差异基因中处于中枢的核心调控基因;以显著性GO与显著性Pathway中的基因取交集，以交集基因为研究对象，根据表达谱芯片的信号值，分别构建Control组和Case组的共表达网络，聚焦起核心作用的基因群体。并用拓扑分析法对LPS、HMGB1刺激下JS1、JS2细胞中的交集差异基因进行模块分析，获得主要的TLR4依赖的差异表达基因归属的功能模块。
　　结果:1.JS1与JS2相比较在基础条件下（无外加内外源配体刺激）基因转录谱有显著差别，差异基因分析得到5421个差异探针，其中上调基因2748个，下调基因2673个，这些基因中包括:纤维化发生相关基因（如ColⅠ、ColⅢ、FN1）、基质重构(TIMP2、TIMP3、MMP2)、生长因子及受体(VEGFD、FGF7、IGF1及IGF1R、PDGFα及PDFGRα、PDGFRβ)、趋化因子及受体(CXCL12、CXCL11、CXCR7)、炎症与免疫(IL6)、转录因子(Jun、STAT3)及重要信号分子(MAPK1)等。功能及信号通路分析显示这些基因主要与纤维化、炎症与免疫、细胞周期、凋亡、肿瘤等相关，并可参与肿瘤、NOD-样受体信号、mTOR信号、JAK-STAT信号、趋化因子信号、细胞粘附信号及免疫相关信号等的调节。基因相互作用网络分析结果示Pik3r3、多种组织相容复合物H2家族分子、MAPK1及3、PDGFRα及β、JAK2、PTK2、PRKCA、integrinα及β分子、IGF1及其受体、Jun等可能是基因表达网络的核心调控因子。共表达分析显示TLR4、Selp、GSK3β、Ephb3、SDC3、Atp6ap1、FZD4、integrinβ5、PAK3、FN1、Dapk1、Rps6ka1、Sema4f、 caspase3、Fcgr3、Pias1等是两种细胞差异基因表达中起核心调控作用的基因群体。2.LPS或HMGB1刺激下JS1、JS2两种细胞的转录谱改变有显著差别，功能分析示这些差异基因主要影响HSC代谢、增殖、凋亡、免疫等功能。信号通路分析示:在JS1中，LPS可上调参与Toll样受体信号、神经营养因子信号、免疫相关信号、剪接体和核苷酸切除修复等信号通路的基因，下调PPAR信号通路;在JS2中，LPS可下调PPAR信号、肾素-血管紧张素信号。基因相互作用网络分析结果示TLR4完整的JS1细胞中LPS刺激下多种组织相容复合物2分子(如H2-B1、H2-Q2、H2-Q10、H2-T10)、MAPK及激酶分子、Pik3r3、PRKCA、Iκbκb等是基因表达网络的核心调控因子;HMGB1刺激下多种MAPK及激酶分子、TRAF6、IGF1R、GPX4、Cyp2e1、Gstp、Gsst、Mgst3等是基因表达网络的核心调控因子;JS2细胞中LPS及HMGB1刺激下差异表达基因相互作用网络简单并缺少显著核心调控因子。共表达分析显示JS1细胞在LPS刺激后多种MAPK及激酶分子、PDGFα、Herc1、Rb1、FGF18、CDK4、CDK7、PRKCA等是起核心调控作用的基因群体;HMGB1刺激下Herc1、JAK1、ODC1、Hist4h4、TRAF6、MAPK、PRKCA等起到核心调控作用;在JS2细胞中LPS或HMGB1刺激下共表达网络群体与JS1细胞缺少相似性。3.拓扑分析TLR4依赖的LPS及HMGB1共同诱导的差异基因，获得29个主要的功能模块，主要影响细胞骨架形成、脂肪代谢、整合素信号传导通路、氧化应激、趋化因子及受体、跨膜受体信号传导、免疫等方面的功能。
　　结论:TLR4信号途径对基础及TLR4内外源性配体刺激下HSC基因转录谱的改变有重要影响，参与调节HSC的纤维化发生、炎症和趋化特性，以及生长、凋亡和代谢等多方面的功能相关基因的表达。
　　第二部分 Toll样受体4信号途径对肝星状细胞-肝癌细胞间相互作用的影响
　　目的:研究Toll样受体4(TLR4)信号途径介导的肝星状细胞(HSC)对肝癌细胞(HCC)生物学特性的影响和机制。
　　方法:采用实时荧光定量PCR法、Western Blot法、酶联免疫法(ELISA)从转录和翻译水平验证差异基因的表达和其中分泌型蛋白的分泌;采用野生型(JS1)及TLR4基因敲除型(JS2)肝星状细胞和肝癌细胞(HepG2、Hepa1-6)间接共培养法及CCK8法检测两种HSC对肝癌细胞增殖的影响。
　　结果:1.与JS2细胞相比，JS1细胞中纤维化相关基因ColⅠ、ColⅢ、FN1，转录因子SP1、STAT3、Fas及细胞生长和炎症趋化因子FGF7、IGF1、FIGF、IL6、CXCL12、CXCR7等的mRNA表达水平明显上调;ColⅠ、MMP2、DLK1、IGF1、FIGF、CXCL12的蛋白水平上调;而PDGFα、CXCL11、CXCR4的mRNA表达无明显变化。2.JS1、JS2均可促进HepG2、Hepa1-6细胞的增殖，但以JS1的作用较为明显。
　　结论:TLR4信号途径介导HSC的纤维化发生、炎症表型等重要生物学特性，并介导HSC表达趋化因子CXCL12及受体CXCR7，以及生长因子VEGFD。HSC具有促进共培养的肝癌细胞增殖的能力，可能与TLR4介导的CXCL12、VEGFD等表达上调有关。

目录

摘要

缩略词表

前言

第一部分 Toll样受体4信号途径对肝星状细胞基因表达网络的调节作用

材料和方法

实验结果

讨论

第二部分 Toll样受体4信号途径对肝星状细胞-肝癌细胞间相互作用的影响

材料方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

附表

综述

工作总结

致谢

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