PPARγ蛋白的体液表达及其对母胎界面滋养细胞和蜕膜基质细胞生物学功能的影响

摘要

第一部分 PPARγ蛋白在GDM孕妇及正常妊娠孕妇外周血、新生儿脐血及羊水中的表达
　　目的:通过检测GDM孕妇及正常妊娠孕妇外周血、新生儿脐血及羊水中PPARγ蛋白的表达，了解PPARγ是否在人体液组织内表达，并比较其在GDM孕妇与正常妊娠孕妇的体外表达有无差异。
　　方法:选取在复旦大学附属妇产科医院产科2012年10-11月足月妊娠行选择性剖宫产的GDM孕妇和正常妊娠孕妇各30例，孕38-41周期间选择性剖宫产手术时采集孕妇外周血、新生儿脐血及羊水。ELLSA方法检测GDM孕妇及正常妊娠孕妇外周血、新生儿脐血及羊水中PPARγ蛋白的表达。
　　结果:GDM足月妊娠孕妇血浆中PPARγ蛋白浓度(0.201 ng/ml)高于正常足月孕妇血浆中PPARγ蛋白浓度（0.153ng/ml），其差异有显著性(P＜0.001)。GDM足月妊娠新生儿脐带血浆及羊水中PPARγ蛋白浓度与正常足月孕妇新生儿脐带血浆及羊水中PPARγ蛋白浓度，无统计学差异。
　　结论:本研究首次发现了细胞内的核转录因子PPARγ蛋白在细胞外液即人体液组织中的表达，我们推测PPARγ可能通过一定的机制由细胞内释放至细胞外，并且为了维持胎儿体内及羊水中PPARγ蛋白的稳态，GDM孕妇外周血的PPARγ蛋白反应性的增高，但PPARγ蛋白影响母胎界面细胞功能需要进一步研究。
　　第二部分 PPARγ蛋白在GDM孕妇胎盘、羊膜、绒毛膜的定位
　　目的:通过分析GDM孕妇胎盘、羊膜、绒毛膜上PPARγ蛋白的定位表达，了解PPARγ蛋白在母胎界面可能的功能。
　　方法:选取在复旦大学附属妇产科医院产科2012年10-11月足月妊娠行选择性剖宫产的GDM孕妇的胎盘、羊膜、绒毛膜组织各5例。免疫组化方法检测PPARγ蛋白的表达。
　　结果:在GDM孕妇的胎盘组织中，PPARγ阳性表达，主要表达在合体滋养细胞核，细胞滋养细胞未见明显表达。在GDM孕妇羊膜组织中，PPARγ阳性表达，表达主要位于羊膜上皮层中的单层立方上皮细胞的细胞核内、成纤维细胞层中的成纤维细胞细胞核内及无定形基质内。在GDM孕妇绒毛膜组织中，PPARγ阳性表达，表达主要位于网状层的细胞的细胞膜上及成纤维细胞细胞核内。
　　结论:在胎盘层面，PPARγ蛋白定位于胎盘的合体滋养细胞核、细胞质，可见PPARγ蛋白不仅定位于细胞核内，有可能通过细胞损伤分泌到细胞质、细胞外的可能，进一步支持了临床实验过程中脐血血浆、羊水中检测到PPARγ蛋白的表达。在羊膜、绒毛膜层面，PPARγ蛋白定位于羊膜上皮细胞核、无定型基质内及绒毛膜网状层细胞的细胞膜上，进一步支持了胎膜的分泌功能，有可能PPARγ蛋白通过胎膜的分泌功能分泌进入羊水。由此可见PPARγ蛋白可能通过内分泌分泌到外周循环，进而发挥作用。
　　第三部分 PPARγ蛋白对细胞糖、脂代谢能力的影响
　　目的:建立滋养细胞和子宫内膜基质细胞的体外诱导的共培养体系，模拟母胎界面细胞间的相互作用，通过改变PPARγ蛋白在共培养体系中的浓度，分析滋养细胞合体化相关分子、子宫内膜基质细胞容受性相关分子以及两种细胞糖、脂代谢能力的改变，进一步了解PPARγ是否发挥母胎细胞交互作用的调节，其调节作用是否影响细胞的糖、脂代谢功能的改变。
　　方法:采用人绒癌滋养细胞株（BeWo细胞）及子宫内膜基质细胞（ESC细胞）建立细胞共培养体系，在共培养的培养液中加入纯化的PPARγ蛋白，改变细胞培养微环境中游离PPARγ蛋白的浓度，分别设立PPARγ蛋白浓度为0.25ng/μL、5 ng/μL、10 ng/μL。RT-PCR方法检测细胞葡萄糖转运体1(GLUT1)、硬脂酰CoA去饱和酶(SCD)的表达，检测滋养细胞合体化分子syncytin的表达，检测子宫内膜基质细胞容受性相关分子血管内皮生长因子(VEGF)的表达。油红O染色法观察共培养体系中BeWo细胞和ESC细胞对脂质的储存能力改变。
　　结果:1）BeWo细胞GLUT1 mRNA、SCD mRNA的表达:单独培养体系中，在各浓度PPARγ作用下，BeWo细胞表达Glut1 mRNA、SCD mRNA相对表达率均无差异性。在共培养体系中，在PPARγ蛋白浓度为10ng/ml、5ng/ml时，BeWo细胞表达Glut1 mRNA相对表达率相对空白对照组有显著性增高(P＜0.05)，SCD mRNA相对表达率随着PPARγ蛋白增加有一定增高趋势，但是无统计学差异。共培养体系相对单独培养体系BeWo细胞Glut1 mRNA、SCD mRNA相对表达率数值上有一定升高，仅在PPARγ蛋白浓度为10ng/m，SCD mRNA相对表达率的升高有统计学差异(P＜0.05)。
　　2) ESC细胞中GLUT1 mRNA、 SCD mRNA的表达:单独培养体系、共培养体系中ESC细胞表达Glut1 mRNA、SCD mRNA无差异性。
　　3) BeWo细胞内脂质储存能力:在共培养体系中，随着蛋白浓度的调高，油红O染色发现，BeWo细胞质内脂肪的含量增多，PPARγ蛋白的浓度为10ng/ml的时候，BeWo细胞质内脂肪的含量明显增多。
　　4) ESC细胞内脂质储存能力:在共培养体系中，随着蛋白浓度的调高，油红O染色发现，ESC细胞质内脂肪的含量增多，PPARγ蛋白的浓度为10ng/ml的时候，ESC细胞质内脂肪的含量明显增多。
　　5) BeWo细胞合体化相关因子的表达:单独培养体系中，随着蛋白浓度的调高，RT-PCR检测BeWo细胞表达Syncytin mRNA有一定增加趋势，但无统计学差异。共培养体系中，Syncytin mRNA的相对表达率随着蛋白浓度的调高，没有趋向性。6) ESC细胞容受性相关因子的表达:单独培养体系、共培养体系中ESC细胞表达VEGF mRNA无差异性。
　　结论:在BeWo细胞和ESC细胞糖脂转运代谢的研究发现，仅在共培养体系中，发现PPARγ蛋白浓度为5ng/ml、10ng/ml时，BeWo细胞表达Glut1 mRNA相对表达率相对空白对照组有显著性增高，且共培养体系相对单独培养体系中Glut1mRNA、SCD mRNA相对表达率有升高趋势，PPARγ蛋白浓度为10ng/ml时，SCDmRNA相对表达率的升高有统计学差异，有可能PPARγ蛋白依靠BeWo细胞和ESC细胞之间的相互影响发挥调节细胞糖代谢的作用。油红O染色发现BeWo细胞和ESC细胞内脂滴的累积随着PPARγ蛋白的浓度的增高有一定增加，随着PPARγ蛋白的浓度的增高，BeWo细胞和ESC细胞对于脂肪的储存能力明显提高，表明PPARγ蛋白可以促进细胞改善细胞脂肪代谢，有可能可以改善外周循环中高血脂的情况。
　　BeWo细胞合体化因子syncytin的分泌在单独培养体系梯形增加，且光镜下BeWo细胞合体化增加，表明PPARγ蛋白作用于BeWo细胞，一定程度上促进了滋养细胞的合体化，但其量的积累尚未达到质的变化，因此虽未见统计学差异，但仍表明在PPARγ蛋白作用下BeWo细胞的合体化仍处于较好的状态，未出现滋养细胞融合异常。而在共培养体系随着PPARγ蛋白浓度的增高，BeWo细胞表达Syncytin mRNA水平无差异，表明有可能在ESC细胞的影响，BeWo细胞融合异常。ESC细胞的VEGF mRNA表达率，未随着PPARγ蛋白浓度的增高而发生变化，说明细胞外液的PPARγ可能对子宫内膜细胞的容受性无明显影响。
　　综上所述，可见PPARγ蛋白促进共培养体系中滋养细胞糖转运蛋白GULT1和脂代谢蛋白SCD的表达，并促进共培养体系两种细胞对脂质的摄取，而对两种细胞合体化分子Syncytin和容受性分子VEGF无明显影响，推测细胞外液的PPARγ蛋白可能影响了母胎界面细胞的糖脂转运功能，可以促进细胞对脂质的摄取。结合第一部分的临床试验结果，考虑GDM孕妇外周血PPARγ增高可能是代偿性增高，可以增加母胎界面细胞对糖和脂的摄取转运，以维持胎儿的稳态。

目录

英文缩略词

摘要

前言

第一部分 PPARγ蛋白在GDM孕妇及正常妊娠孕妇外周血、新生儿脐血及羊水中的表达

1．研究背景

2．实验部分

3 结果

4 讨论

第二部分 GDM孕妇胎盘、胎膜中PPARγ蛋白的定位

1．研究背景

2．实验部分

3 结果

4 讨论

第三部分 PPARγ蛋白对细胞糖、脂代谢能力的影响

1 研究背景

2 实验部分

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

综述：过氧化物酶体增殖物激活受体γ与妊娠期糖尿病

附录Ⅱ 在校期间发表综述

致谢

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