Aurora-A通过异常调节DNA损伤应答促进肿瘤放化疗抵抗

摘要

研究背景:
　　肿瘤细胞放化疗抵抗常可导致肿瘤预后不良。Aurora-A激酶(Aurora-A)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，与有丝分裂的纺锤体分离，中心体复制相关，且在多种肿瘤中均高表达，是一种重要的癌基因。近期研究表明Aurora-A可促进肿瘤放化疗抵抗，由于Aurora-A与p53，BRCA1，BRCA2等多种DNA损伤应答蛋白有着相互作用，因此我们推测Aurora-A很可能通过调节DNA损伤应答促进肿瘤放化疗抵抗。
　　研究目的:
　　研究Aurora-A与DNA损伤应答的关系，揭示Aurora-A促进肿瘤放化疗抵抗的机理，探寻Aurora-A相关肿瘤的新型靶向药物分子，以期达到肿瘤治疗的最佳效果。
　　材料和方法:
　　第一部分.观察Aurora-A对细胞增殖的影响。
　　1).在乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌细胞中选择Aurora-A低表达的细胞系(MCF-7，PANC-1和OVCA420)，和Aurora-A高表达的细胞系(MDA-MB-231，BXPC3和OVCA429)，通过反转录病毒法转入或沉默Aurora-A。
　　2).通过细胞计数和软琼脂克隆形成试验分别绘制细胞生长曲线和克隆形成率柱状图。
　　3)用流式细胞术检测细胞周期进展。
　　第二部分.检测Aurora-A对肿瘤放化疗抵抗的影响。
　　1).用放射线，顺铂或者Aurora-A抑制剂VX680处理细胞后，通过流式细胞术检测细胞凋亡水平。
　　2).用MTT检测顺铂处理后的细胞活力，并计算细胞半数抑制浓度(IC50)。
　　第三部分.探究Aurora-A引起肿瘤放化疗抵抗的机理
　　第一章.检测Aurora-A与DNA损伤应答的关联
　　1).免疫荧光检测Aurora-A与γ H2AX的关联。
　　2).免疫印迹检测Aurora-A对DNA损伤应答蛋白(ATM， Chk2，ATR，Chk1，RAD51,H2AX,γ2AX,ERCC2,p53,pp53,AKT1,AKT2)的影响。
　　第二章.检测ATM抑制剂对肿瘤放化疗抵抗和DNA损伤应答的影响。
　　1).用ATM抑制剂KU-55933处理细胞，然后用流式细胞术检测细胞凋亡水平。
　　2).用免疫印迹检测ATM抑制剂对DNA损伤应答蛋白(pp53，Chk2，γH2AX，RAD51等)的影响。
　　第三章.检测BRCA1/2与Aurora-A之间的关系，并研究BRCA1/2对肿瘤放化疗抵抗的影响以及与DNA损伤应答之间的关联。
　　1).在乳腺癌，胰腺癌和卵巢癌细胞中选择Aurora-A低表达的细胞系(MCF-7，PANC-1和OVCA420)，以及Aurora-A高表达的细胞系(MDA-MB-231，BXPC3和OVCA429)，通过反转录病毒法或Fugene6转染试剂使细胞沉默或者过量表达BRCA1/2。
　　2).用免疫印迹检测BRCA1/2与Aurora-A之间的关联。
　　3).通过细胞计数和软琼脂克隆试验分别绘制细胞生长曲线和克隆形成率柱状图。
　　4).用流式细胞术检测细胞周期进展。
　　5).细胞放化疗处理后用流式细胞术检测细胞凋亡水平。
　　6).免疫印迹检测BRCA1/2对DNA损伤应答蛋白(p53，pp53，ATM，Chk2，RAD51，γH2AX)的影响。
　　结果:
　　第一部分
　　Aurora-A可促进细胞增殖，细胞周期进展和软琼脂克隆形成，而Aurora-A沉默可抑制细胞增殖，细胞周期进展和克隆形成。
　　第二部分
　　放化疗处理后，Aurora-A转入的细胞系凋亡明显降低，而Aurora-A沉默或者用Aurora-A抑制剂VX680处理的细胞系凋亡明显增加;顺铂处理后，Aurora-A转入的细胞系IC50增加，而Aurora-A沉默的细胞系IC50降低。
　　第三部分
　　第一章.Aurora-A降低了放射后γH2AX灶点形成，且Aurora-A可异常调节DNA损伤应答。
　　第二章.ATM抑制剂可增加放化疗引起的肿瘤细胞凋亡，并且影响DNA损伤应答蛋白表达。
　　第三章.BRCA1/2与Aurora-A负相关，且BRCA1/2可抑制细胞增殖，体外克隆形成和细胞周期进展，并可通过影响DNA损伤应答增加放化疗引起的细胞凋亡。
　　结论:
　　研究发现，Aurora-A过表达可促进肿瘤细胞增殖，细胞周期进展，软琼脂克隆形成，并可直接或者间接通过上调ATM表达，下调BRCA1/2表达，调节DNA损伤应答，促进肿瘤放化疗抵抗;相反的，Aurora-A沉默可抑制细胞增殖，细胞周期进展，软琼脂克隆形成，并可直接或者间接通过下调ATM表达，上调BRCA1/2表达，调节DNA损伤应答，促进肿瘤放化疗敏感。如此，Aurora-A可通过调节DNA损伤应答促进肿瘤放化疗抵抗，于是我们建议，在针对Aurora-A高表达的细胞系进行靶向治疗和研究时，DNA损伤应答相关的分子也应该被考虑在内。

目录

全文英文缩写索引

摘要

前言

参考文献

第一部分 Aurora-A促进细胞增殖，体外克隆形成以及细胞周期进展

引言

材料和方法

结果及结论

第二部分 Aurora-A促进肿瘤放化疗抵抗

引言

材料和方法

结果及结论

第三部分 Aurora-A引起肿瘤放化疗抵抗的机理研究

第一章 Aurora-A异常调节DNA损伤应答

引言

材料与方法

结果及结论

第二章 Aurora-A上调ATM促进肿瘤放化疗抵抗

引言

材料和方法

结果及结论

第三章 Aurora-A下调BRCA1／2促进肿瘤放化疗抵抗

引言

材料和方法

结果及结论

讨论

参考文献

综述：Aurora-A激酶和BRCA蛋白在肿瘤中的研究进展

致谢

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