细胞外RNA初步克隆分析及miRNA-483前体相互作用蛋白的筛选

摘要

RNA广泛存在于生命活动的各个过程，并在其中发挥着重要的功能。但是，人们对细胞外RNA(extracellular RNA，eRNA)还知之甚少。microRNA(miRNA)的发现使我们对基因表达调控有了一个全新的认识，但是miRNA前体的加工途径的精细过程还不是很清楚。 为了探索细胞外RNA的生物学功能，本研究以HepG2细胞为研究模型，通过RNA酶A的对细胞的离散作用及RNA抗体的细胞免疫荧光实验验证了细胞表面RNA分子的存在，研究了细胞培养液中RNA含量的变化。通过冻干法富集了细胞培养液中的RNA，并采用本室建立的RNA克隆方法对其进行了克隆。同时我们利用酵母三杂交技术筛选了本室克隆出的新的microRNA-48前体的相互作用蛋白。本研究取得的具体进展如下： 1．用RNA抗体细胞免疫荧光检测，证实了HepG2细胞表面存在RNA分子。 2．发现RNA酶A能使HepG2细胞离散，迁移能力增强，细胞表面伪足增加。 3．检测了HepG2细胞生长过程中培养液中和细胞表面RNA含量的变化。 4．建立了冻干浓缩提取细胞培养液中RNA的方法，并建立了细胞培养液RNA克隆方法，得到了若干条细胞培养液中的RNA，其中包括rRNA片段、人延伸因子1α亚单位、线粒体RNA片段和立克次氏体RNA，其中一条位于15号染色体CpG岛区的28nt的RNA与新发现的piRNA有很高的相似性。 5．用酵母三杂交技术得到了microRNA-483前体候选相互作用蛋白，其中C140FR108和ZNF43得到了回转验证。 RNA在生命活动中的作用已经得到了人们的认可。细胞外RNA的研究也已经初见端倪，本研究以证实了细胞外RNA的存在，建立了细胞外液RNA的提取和克隆方法，获得了一些有特点的RNA；为细胞外RNA的研究建立了新的方法。可以用于疾病的检测，同时为深入研究RNA在生命活动过程中的作用奠定了良好的基础。通过酵母三杂交技术筛选了与microRNA-483相互作用的蛋白质，为microRNA-483的加工机制研究提供了线索，同时为microRNA功能的研究提供了新的思路。

目录

论文说明：英文缩略语表

声明

前 言

第一部分细胞外RNA存在的验证及细胞培养液中RNA定量分析

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

参考文献

第二部分细胞外液RNA的初步克隆分析

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

小 结

参考文献

第三部分酵母三杂交技术筛选miRNA-483前体相互作用蛋白

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

参考文献

总 结

致 谢

已发表文章

附 录

综 述：细胞外RNA的研究进展