缓激肽多肽片段间非共价作用的质谱研究

摘要

近年来，随着质谱学技术在生命科学领域的广泛应用，有关气相多肽和蛋白质分子结构的研究取得了很多进展。随着软电离技术的发展，特别是电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)等技术的出现，多肽和蛋白质样品在分析的过程中，可以“完整”地由溶液进入气相而被检测，在接近生理状态下获得分子相互作用的化学计量比、结合势和能量信息。这种“软”电离技术不但使得一些热不稳定、强极性、难挥发的化合物可以被检测，而且使得质谱的应用范围从小分子扩展到蛋白质等生物大分子。因此，电喷雾质谱已经成为研究蛋白质以及多肽之间非共价相互作用的有效手段之一。
　　本论文的工作就是利用电喷雾电离质谱为主要研究手段，对缓激肽分子多肽片段间的非共价-氢键相互作用和多肽之间形成的非共价复合物的碎片化反应以及两端封闭的多肽间的非共价-氢键相互作用进行了研究。
　　首先是使用电喷雾电离质谱(ESI-MS)研究了缓激肽分子碎片片段之间的非共价相互作用。为了探讨影响气相多肽分子构象稳定的氢键作用，合成了与缓激肽分子(R1P2P3G4F5S6P7F8R9)在位置1断裂形成的碎片一致的RPPGFS和PFR多肽序列，与在位置2断裂形成碎片一致的RPPGF和SPFR多肽，以及N端或者C端去掉精氨酸的相应碎片多肽。实验结果表明，上述两个断裂位置产生的碎片多肽分别进行反应后，都能发生非共价作用。在断裂方式1下，PFR在去掉C端精氨酸后，与其他大多数多肽不发生非共价结合，表明PFR中的精氨酸在缓激肽气相分子的构象中发挥重要的作用。而在断裂方式2下，去掉N端或者C端精氨酸的多肽之间都存在非共价结合，即C端带有丝氨酸的SPF或SPFR多肽碎片仍然可以与N端碎片发生氢键结合，表明丝氨酸很可能处于转角的位置。
　　然后我们采用质谱滴定法定量测得了多肽RPPGFS和PFR的结合常数为3.53×103，与多肽RPPGF和SPFR的结合常数(3.16×103)相接近，它们均大于去掉精氨酸的PPGF和SPF的结合常数(1.25×103)。
　　我们还通过电喷雾电离结合碰撞诱导解离技术分析了形成的非共价复合物的碎片化反应。通过对碰撞诱导解离的碰撞能量分析，发现多肽RPPGFS和PFR，以及多肽RPPGF和SPFR之间氢键结合较强，而同时去掉N端和C端精氨酸得到的多肽之间的氢键结合较弱。对缓激肽分子在位置1和位置2断裂合成的多肽RS-6(RPPGFS)和多肽PR-3(PFR)，多肽RF-5(RPPGFS)和多肽SR-4(SPFR)形成的非共价复合物，在50 eV碰撞能量下得到的碎片离子进行归属，可以发现都存在b-y碎裂的碎片离子，同时存在中性脱落的水分子(H2O，18)，甲醛分子(CH2O，30)，或者是精氨酸胍基上的氨基脱落(CN2H2，42)、(CN3H5，59)。
　　第三部分为了探讨缓激肽分子两端的精氨酸残基对于缓激肽多肽片段间非共价作用的影响，我们设计合成了两端封闭的缓激肽多肽片段。同样是在缓激肽分子的位置1和位置2断裂合成两条多肽，不同的是将这些多肽的N端进行乙酰化CH3CO-，C端进行酰胺化-NH2，两端封闭后的多肽之间形成非共价复合物的能力比未封闭之前更难。这是由于封闭后的多肽侧链形成了稳定的结构，使得多肽两端的氨基酸残基的侧链不容易与其他多肽的侧链产生非共价的氢键作用。通过碰撞诱导解离实验发现，多数非共价复合物在碰撞能量为20eV的时候开始产生相应的单个多肽的碎片离子，少数非共价复合物在25eV时出现相应的多肽碎片。在碰撞能量为30eV～45eV的范围内，形成的非共价复合物的峰强度会降低到最强峰强度的10％以下。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 缓激肽分子的结构

1．1．2 缓激肽分子的生物学功能

1．1．3 影响缓激肽分子空间结构的因素

1．2 分子间的非共价相互作用

1．2．1 多肽间非共价复合物的形成

1．2．2 非共价相互作用的研究方法

1．2．3 质谱法在非共价作用研究中的应用

参考文献

第二章 实验技术

2．1 电喷雾电离质谱技术

2．1．1 质谱技术概述

2．1．2 电喷雾电离质谱原理

2．1．3 碰撞诱导解离

参考文献

第三章 缓激肽多肽片段间非共价作用的质谱研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 样品及试剂

3．2．2 多肽溶液的制备

3．2．3 仪器及实验条件

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 八种多肽混合液的电喷雾质谱结果

3．3．2 不同断裂位置下碎片多肽之间的非共价作用

3．3．3 去掉N端或C端精氨酸后合成的多肽间相互作用

3．3．4 任意两种多肽间的非共价结合情况

3．3．5 结合常数的测定

3．4 结论

参考文献

第四章 非共价复合物的碎片化反应研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 样品及试剂

4．2．2 仪器及实验条件

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 碰撞诱导解离实验

4．3．2 不同碰撞能量下的CID结果

4．4．3 可能的碎裂位点及碎片的归属情况

4．4．4 对比完整的缓激肽分子的碎片情况

4．4 结论

参考文献

第五章 两端封闭的缓激肽多肽片段间的非共价作用的质谱研究

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 样品及试剂

5．2．2 仪器及实验条件

5．3 实验结果与讨论

5．3．1 八种封闭的混合肽的电喷雾质谱结果

5．3．2 两端封闭的多肽的非共价结合情况

5．3．3 封闭多肽的碰撞诱导解离结果

5．5 结论

参考文献

第六章 论文总结与展望

发表论文情况

申请中国发明专利和实用新型专利各一项

致谢

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