一种新型狂犬病毒表位复合疫苗的筛选、鉴定及其免疫原性研究

摘要

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus)引起的人兽共患的世界性传染病，每年全世界有超过55，000人死于狂犬病毒的感染，中国是狂犬病的高发国家之一。动物或人感染狂犬病后，病毒会进入中枢神经系统，引起神经细胞功能的紊乱，一旦发病，目前无法医治，疫苗是唯一能够预防狂犬病的方法。
　　狂犬病疫苗的开发已经有120多年的历史，目前中国使用的疫苗是由狂犬病毒弱毒株开发的灭活疫苗，且自从2005年之后，国内生产的疫苗中都不含有任何佐剂。因此现有的疫苗往往存在免疫原性较差、抗体产生缓慢、免疫程序繁琐等不足，在严重咬伤的情况下，还需要注射昂贵的免疫球蛋白进行辅助治疗。另一方面，由于狂犬病毒的潜伏期最短在7天左右，在注射疫苗后仍然有可能由于机体未能产生有效的体液免疫和细胞免疫而发病，造成严重后果。因此开发新型狂犬疫苗是解决现有疫苗不足的有效途径，而国内外关于改进现有狂犬疫苗的研究报道并不多，仅仅停留在改进免疫策略或者探索使用基因工程技术改造疫苗等，取得有效进展的很少。
　　本文主要从疫苗佐剂和表位疫苗的角度开发了一种新型狂犬病毒复合表位疫苗，研究内容分为如下几个部分:
　　首先，本文初次研究了单磷酰脂质A(MPLA)作为狂犬疫苗佐剂促进机体免疫应答的机制，证明了其作为狂犬疫苗潜在佐剂的可行性。研究证明MPLA作为一种已知的TLR4配体，一方面能够加快特异性狂犬病毒抗体在机体内产生的速度，另一方面能够诱导小鼠产生具有细胞杀伤作用的Tc细胞和以Th2型为主的免疫应答反应，并诱导免疫细胞产生IFN-γ和IL-4。
　　其次，本文从表位疫苗的角度出发，筛选出4条狂犬病毒的细胞表位，为下一步狂犬病表位疫苗的研究奠定了基础。这部分的研究以BALB/c小鼠为哺乳动物模型，通过生物信息学手段，从狂犬病毒糖蛋白和核蛋白中预测出12条细胞表位，并利用免疫学实验方法（ELISPOT、流式细胞术等），从12条表位中筛选出4条狂犬病毒的候选表位（G367-381、G333-341、N92-106和N409-423），这些表位经过体外实验验证，证明其能够促进淋巴细胞增殖、细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌及T细胞的分化。其中G333-341作为CTL表位，而G367-381、N92-106和N409-423作为Th表位。
　　最后，本文进一步将筛选到的细胞表位加上棕榈酸基团，合成了4条不同的多肽，添加MPLA研制成了一种狂犬病毒复合表位疫苗，并在动物体内进行了初步的机理研究。通过免疫BALB/c小鼠以及检测其相关细胞免疫应答指标，发现合成的多肽中，多肽C具有显著的促进Th1类免疫应答的作用，多肽B和多肽D能够部分促进Th1类和Th2类免疫应答。
　　综上所述，本研究从疫苗佐剂和表位疫苗的角度出发，初步证明了MPLA+脂肽表位疫苗的组合能够促进机体Th1/Th2类细胞免疫应答，可能有助于机体清除病毒的感染，也有利于解决目前狂犬病疫苗的种种不足，为下一步开发新型高效狂犬疫苗提供了实验基础和新思路。

目录

部分缩略词表一览

摘要

综述部分

第一章 狂犬病及狂犬病疫苗概述

第二章 疫苗佐剂研究进展

第三章 表位疫苗研究进展

第四章 脂肽疫苗研究进展

实验部分

第一章 单磷酰脂质A(MPLA)增强BALB／c小鼠对于狂犬病疫苗体液和细胞免疫的研究

第一节 前言

第二节 实验材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论总结

第二章 狂犬病毒糖蛋白及核蛋白BALB／c小鼠MHC限制性CTL与Th表位的预测与鉴定

第一节 前言

第二节 实验材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论总结

第三章 狂犬病毒蛋白脂肽表位疫苗的体内鉴定研究

第一节 前言

第二节 实验材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论总结

全文总结和展望

参考文献

附录一 多肽合成报告

附录二 在读期间获得的学术成果和奖励

致谢

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