表面修饰型载乳糖酶聚合物纳米粒的制备及克服乳糖不耐症的研究

摘要

乳糖是牛奶中的主要碳水化合物，并且还广泛的存在于乳制品和加工食品以及药品中。β-半乳糖苷酶（乳糖酶）位于小肠黏膜的刷状缘，能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。然而，70％以上的世界人口，在断奶之后会渐渐地失去合成乳糖酶和水解乳糖的能力从而导致乳糖不耐症。缺乏乳糖酶，乳糖不能在小肠消化吸收，从而到达结肠，在那里它通过结肠细菌发酵并增加了渗透压，这可能导致腹部疼痛，肠鸣腹胀，腹泻，甚至头痛和注意力分散等临床症状。目前治疗乳糖不耐症的方法主要是补充外源性乳糖酶。口服由微生物产生的乳糖酶制剂，如胶囊和片剂，已证明可以成功地减少胃肠道不适的症状但是会产生依赖性。然而，由于小肠中的酶促降解和较短的存留时间，目前为止最有效的方法是在摄入乳糖之前或与之一起服下乳糖酶制剂。因此，寻找一个长效且能保护乳糖酶和进行黏膜靶向的制剂是十分必要的。由生物相容性、可生物降解的、FDA批准可以使用的PLA或PLGA为壳材的聚合物纳米粒，是多孔，半渗透，允许小分子透过的，但蛋白质或酶不能透过。可以想象，乳糖酶被包埋在PLA或PLGA的纳米粒可使乳糖透过，但蛋白或酶被截留在外面从而防止酶促降解。纳米粒靶向定位到黏膜上广泛使用方法是利用表面吸附或偶联基团可以特异性结合于肠黏膜上。
　　1、将小麦胚芽凝集素（WGA）与水溶性壳聚糖（WSC）共价结合，通过物理吸附协同修饰聚乳酸纳米粒，使β-半乳糖苷酶靶向定位到肠黏膜。采用复乳溶剂挥发法制备的经过表面修饰的载乳糖酶聚乳酸纳米粒的粒径范围在500~600 nm之间。
　　2、β-半乳糖苷酶包埋在纳米粒中不仅阻止了外部的蛋白水解作用而且可以使乳糖渗透到纳米粒中从而提高乳糖水解率。无论纳米粒的表面有无WGA，WSC的存在都大大提高了纳米粒的悬浮稳定性并且会使纳米粒表面带正电荷。
　　3、通过体外实验证明，表面用WGA和WSC与单独用WSC修饰的纳米粒相比较而言，WGA和WSC的协同修饰极大地增强了纳米粒与黏蛋白的相互靶向作用。
　　4、大鼠经口服给药24 h后，在小肠中发现的纳米粒数量最多。通过计算得出，WGA-WSC-NPs在小肠中的半衰期为6.72 h，分别是WGA-PVA-NPs、WSC-NPs和对照组PVA-NPs的2.1、4.3和6.9倍。这些结果表明，WGA-WSC协同修饰的纳米粒可以通过黏膜靶向给药用于治疗乳糖不耐症。
　　肠溶包衣胶囊是一种有效的为特定肠道口服给药技术，这是基于pH释放敏感聚合物，包括羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯（HPMCP，HP55），聚甲基丙烯酸等等。基于这些方面，本文的研究思路是建立一个口服给药系统-载有乳糖酶聚乳酸的纳米粒肠溶包衣胶囊。基本概念是，肠溶包衣胶囊在胃的高酸性环境中保持不变，但在中性或微碱性的环境小肠中溶解迅速，释放出载乳糖酶聚乳酸纳米粒。
　　1、为了防止口服乳糖酶在胃肠道环境中的降解和充分的分解乳中的乳糖，本实验研制了载乳糖酶聚乳酸纳米粒，并用肠溶衣胶囊封装的双重胶囊递送系统。采用改进的复乳法制备的载乳糖酶纳米粒的大小在100~200 nm之间。
　　2、在制备过程中，采用高压均质，二氯甲烷、乙酸乙酯作为油相，聚乙烯醇或泊洛沙姆188作为内水相稳定剂能有效提高乳糖酶的保留活力。随后，制备好的纳米粒采用冷冻干燥法冻干，用羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯胶囊封装。
　　3、经过体外实验表明：在模拟胃液环境中羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯胶囊能保持完整性，并可以防止包埋的乳糖酶在酸性环境中变性。在模拟肠液环境中，胶囊迅速分解并释放出载乳糖酶聚乳酸纳米粒，与普通的乳糖酶相比，显示出了更高的酶稳定性及水解乳糖率。这些结果表明本实验研究的载乳糖酶双重胶囊封装系统在胃肠道环境中能有效的水解乳糖。

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缩写词

1 文献综述

1.1 乳糖不耐症概述

1.1.1 乳糖

1.1.2乳糖酶

1.1.3 乳糖不耐症

1.2 国内外乳糖酶制剂的研究与进展

1.2.1 聚乳酸纳米微囊

1.2.2 聚乳酸纳米微囊的制备方法

1.2.3 纳米微囊理化性质评价

1.3 胃肠道生物黏附给药系统

1.3.1 生物黏附和黏膜黏附

1.3.2 聚合物附着的黏膜黏附理论

1.3.3 生物黏附性材料

1.4 本课题研究意义与主要内容

2 载乳糖酶聚乳酸纳米微囊优化制备与表征

2.1 材料与方法

2.1.1 试验仪器与试剂

2.1.2 实验方法

2.1.3 纳米粒体内分布

2.2 结果与分析

2.2.1 纳米粒的特性

2.2.2 乳糖酶水解乳糖实验

2.2.3 酶催化乳糖水解

2.2.4 纳米粒的悬浮稳定性

2.2.5 与猪黏蛋白的体外靶向作用

2.2.6 体内分布

2.3 讨论

2.4 小结

3 肠溶包衣载乳糖酶聚乳酸纳米粒的制备与性能研究

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料与仪器

3.1.2 载乳糖酶聚乳酸纳米粒的制备

3.1.3 纳米粒的冻干

3.1.4 纳米粒的形态和粒度分布

3.1.5 乳糖酶活性测定

3.1.6 载乳糖酶聚乳酸纳米粒肠溶包衣胶囊的制备

3.1.7 在模拟胃肠道环境酶稳定性的测定

3.1.8 体外乳糖水解

3.1.9 统计分析

3.2 结果与分析

3.2.1 制备参数对乳糖酶活力的影响

3.2.2 载乳糖酶聚乳酸纳米粒表征

3.2.3 在模拟胃肠液中酶稳定性

3.2.4 乳糖水解作用

3.3 小结

4 结论

参考文献

致谢

附录一 攻读学位期间发表的学术论文目录