三种重金属对斑马鱼发育联合毒性及迷迭香酸干预作用研究

摘要

重金属可通过食物链富集，造成严重的生态毒理效应，并损害人体健康，本研究以模式生物斑马鱼为研究对象，建立了斑马鱼Cd2+、Pb2+、Cu2+三种重金属联合染毒模型，并考察天然抗氧化剂迷迭香酸（Rosmarinic acid，RA）对氯化镉（CdCl2）、硝酸铅（Pb(NO3)2）、硫酸铜（CuSO4）暴露所致斑马鱼发育毒性的干预作用，初步探讨其作用机制。
　　本研究通过致死毒性和致畸性实验研究CdCl2、Pb（NO3）2、CuSO4三种重金属对囊胚期斑马鱼胚胎的发育毒性及RA对重金属发育毒性的干预作用。收集受精1h后（1hpf）的斑马鱼胚胎暴露于含不同浓度迷迭香酸及CdCl2、Pb（NO3）2、CuSO4溶液中，观察96hpf胚胎死亡率和孵化率；采用吖啶橙（AO）染色观察胚胎细胞凋亡情况；用DCFH-DA检测细胞内总活性氧水平，MitoSOX检测线粒体源ROS，JC-1检测线粒体膜电势；采用Long PCR方法检测胚胎细胞线粒体DNA（mtDNA）损伤；用SYBR荧光实时定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）方法检测胚胎mRNA的表达，并用比较CT值法进行相对定量。
　　主要结果及结论：
　　（1）10.0-40.0mg/L CdCl2诱导斑马鱼胚胎死亡及幼鱼畸形，使胚胎孵化率降低，100-450mg/L Pb(NO3)2导致斑马鱼胚胎死亡，胚胎未孵化率较低，1-5mg/L CuSO4对斑马鱼胚胎的孵化率、死亡率影响较大。60μmol/L RA与Cd2+-Pb2+-Cu2+重金属联合处理胚胎死亡率和未孵化率会降低（P<0.01）。Cd2+、Pb2+、Cu2+三种重金属对斑马鱼胚胎半数致死量分别为26.110mg/L、271.984mg/L、3.755mg/L，Cd2+-Pb2+两者联合对斑马鱼胚胎半数致死量分别为16.534mg/L、89.997mg/L，其毒性上升，表现为协同作用；Cd2+-Cu2+两者联合对斑马鱼胚胎半数致死量为13.808mg/L、1.065mg/L，联合毒性为协同作用；Pb2+-Cu2+两者联合对斑马鱼胚胎半数致死量浓度分别为113.805mg/L、2.735mg/L，联合毒性为拮抗作用。Cd2+-Pb2+-Cu2+三者联合对斑马鱼胚胎发育毒性为13.470mg/L、40.410mg/L、3.551mg/L，联合毒性为协同作用。
　　（2）Cd2+-Pb2+-Cu2+联合组可升高胚胎细胞内总ROS和线粒体源ROS水平，降低线粒体膜电势（P<0.01，与空白比较）；60μmol/L RA与Cd2+-Pb2+-Cu2+联合明显降低胚胎细胞内总ROS和线粒体源ROS水平；升高胚胎细胞线粒体的膜电势（P<0.01，与Cd2+-Pb2+-Cu2+联合组比较）。Cd2+-Pb2+-Cu2+联合处理可促进斑马鱼胚胎细胞凋亡（P<0.01，与空白组对比），RA对其起到抑制作用（P<0.01，与Cd2+-Pb2+-Cu2+联合组相比）。
　　（3）Long PCR结果显示：Cd2+-Pb2+-Cu2+重金属处理组mtDNA损伤最严重，RA对重金属造成的mtDNA损伤有一定保护作用，胚胎凋亡细胞数明显减少。Cd2+-Pb2+-Cu2+重金属处理组Sirt1、PGC-1α、Nrf1基因表达下调（P<0.01，与空白组对比）；RA与Cd2+-Pb2+-Cu2+联合组中Sirt1、PGC-1α、Nrf1基因表达上调（P<0.01，与Cd2+-Pb2+-Cu2+联合组相比），Cd2+-Pb2+-Cu2+重金属组Bcl-2/Bax比值降低（P<0.05，与空白比较），Caspase-2基因表达上调（P<0.01），RA与Cd2+-Pb2+-Cu2+共同处理组Bcl-2/Bax比值升高（P<0.05，与Cd2+-Pb2+-Cu2+联合组相比），Caspase-2基因表达下调（P<0.01，与Cd2+-Pb2+-Cu2+联合组相比）。
　　（4）一定浓度下，CdCl2、Pb(NO3)2、CuSO4单独及联合暴露对斑马鱼具有发育毒性，抗氧化剂RA可减弱三种重金属所致的毒性效应，起到保护作用。RA防御Cd2+-Pb2+-Cu2+所致的斑马鱼胚胎发育毒性的机制可能与减少ROS生成，降低胚胎细胞mtDNA损伤，抑制胚胎细胞凋亡相关。

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前言

1 文献综述

1.1 水体重金属的来源及危害

1.2 重金属污染物的毒性效应及致毒机理

1.3 水体中重金属的污染现状

1.4 联合毒性作用及方式

1.5 重金属与氧化损伤

1.6 重金属的线粒体毒性

1.7 线粒体与ROS

1.8 迷迭香酸概述

1.9 模式生物斑马鱼

1.10 研究目的与意义

2 迷迭香酸与三种重金属暴露对斑马鱼胚胎发育的影

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

3 细胞总ROS、线粒体ROS和膜电势的测定

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

4 RA联合Cd2+-Pb2+-Cu2+对斑马鱼胚胎mtDNA损伤、

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

5 RA联合Cd2+-Pb2+-Cu2+对斑马鱼胚胎基因表达的影响

5.1 材料与方法

5.2 结果

5.3 讨论

6 结论

参考文献

致谢

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