海分枝杆菌无机磷酸盐转运调控蛋白PhoY2功能学与调控机制研究

摘要

由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tuberculosis)引起的结核病(Tuberculosis)，目前仍是威胁全球公共卫生安全的重大传染病之一。据世界卫生组织(WHO)2013年数据统计显示:2012年在全球范围内共有结核病新发病例860余万;导致约130万人死亡;其中近32万是与艾滋病(Acquired immunedeficiency syndrome，AIDS)共感染。中国是全球22个结核病高负担国家之一，2012年全国共有新发病例大约95万，并且随着耐药(Drug resistance)尤其是耐多药(Multi-drug resistant)和广泛耐药(Extensively drug resistance)菌株的出现、与艾滋病共感染的病例增加，结核病的防控形势依旧十分严峻。
　　细菌感染人体后，大部分在抗生素的作用下被杀死，然而小部分细菌能够逃避药物的治疗以及机体的免疫杀伤从而长期潜伏于机体内，成为持留菌(persistent cells)。这一现象首先由Joseph Bigger在1944年发现，该部分持留菌在基因型上和被抗生素杀死的敏感菌没有区别，但是由于它们进入了不进行复制的休眠状态(dormant state)从而能够逃逸抗生素的杀伤。有研究结果显示，持留性细菌的形成与TA系统(Toxin-Antitoxin)的随机表达有关。在分枝杆菌研究领域，有结果证明phoY2对结核分枝杆菌持留性的形成不可或缺，并且该结论与在E.coli中对phoY2同源基因phoU的研究结果相一致。但是由于海分枝杆菌缺乏相应的TA系统，故对分枝杆菌尤其是海分枝杆菌持留性的研究及其形成机制目前尚不清楚。
　　多聚磷酸盐(Poly Pi)广泛存在于细菌、古细菌、真菌、原虫、植物以及动物中。其在生物体内由多聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，PPK)直接合成，主要通过外切磷酸酶(exopolyphosphatase，PPX)水解，poly Pi的平衡需要通过PPK以及PPX的协同调节。PPK存在于许多细菌中，但是在真核细胞中缺失。Poly Pi在机体代谢调控过程中发挥着重要作用:调节机体内ATP的含量;重金属离子如镁、钙离子等的螯合物;扮演DNA通道来控制细胞内外DNA的进出。此外，在原核生物中，poly Pi能作为信号分子(messenger)参与细菌对环境压力的应急性应答(Stringent response).Poly Pi的失衡对于细菌生物膜的形成以及Quorumsensing系统对信号的感知均有影响，并且造成细菌毒力的减弱。
　　SenX3-RegX3是结核分枝杆菌所编码的11个双组份系统(two-componentregulatory systems，2CRs)之一。细菌通过自身编码的2CRs感知周围环境的变化，并且有报道显示部分2CRs和细菌毒力相关。由研究结果表明，结核分枝杆菌特异性磷酸转运(phosphate-specific transport，Pst)系统stS3-pstC2-pstA1在磷酸饥饿的环境下表达上调，该表达变化依赖于SenX3-RegX3，并且RegX3为细菌在磷酸饥饿以及小鼠肺部的存活所必需。在耻垢分枝杆菌中(M.smegmatis)，SenX3-RegX3对基因的调控依赖于外界磷浓度的变化。此外，SenX3-RegX3调控结核分枝杆菌ΔpstA1在磷丰富培养基中基因的表达，并且细菌在外界压力条件下以及宿主体内的存活依赖于Pst系统对RegX3活性的负向调控。但是，SenX3-RegX3和细菌对外界磷浓度反应之间的具体信号转导以及调控机制目前仍不清楚。
　　本实验室之前的研究结果显示，M.marinum中pho Y2基因的插入失活导致胞内poly Pi以及ATP浓度上调;处于poly Pi和ATP代谢失调的hoY2∷Tn(05A9)菌株对体外高浓度磷酸盐以及细胞壁裂解剂(SDS)、营养缺陷、抗生素等环境压力更为敏感;此外，其对低氧环境的适应过程也受到了影响。本论文在此基础上，通过对phoY2∷Tn突变株的进一步研究发现:phoY2基因的缺失导致数百个基因的表达发生了变化，其中包括与磷转运调控相关的Pst以及双组分系统se nX3/re gX3;通过反义RNA技术降低PPK活性及突变株体内poly Pi的浓度后，体内poly Pi浓度已经降低至野生株水平的pho Y2∷Tn菌株在体外高浓度磷酸盐、SDS、营养缺陷、抗生素等条件下的表型没有发生变化;PhoY2与Pst系统以及PhoP/PhoR之间在蛋白水平未检测到相互作用;senX3/regX3启动子活性在突变株中明显高于野生株，对该区域进一步分析的结果显示，该区域的转录活性受不同调控因子共同调节;此外，pho Y2∷Tn菌株在体外持留性(persistence)相比于野生株(WT)显著下降。（论文第一章）
　　结核分枝杆菌引起疾病的第一步是成功阻止宿主体内巨噬细胞对其的杀伤。绝大多数的病原菌被巨噬细胞内吞后，都被包裹在吞噬小体中，随着吞噬小体的成熟，这些病原菌被转移至溶酶体，在那里被降解。但是结核分枝杆菌能够成功的阻断吞噬小体和溶酶体的融合，所以能够长时间的在巨噬细胞中存活。关于此过程的分子机制目前尚不清楚。
　　蛋白激酶G(PknG)能够通过阻断吞噬小体和溶酶体的融合，促进结核分枝杆菌在宿主体内的存活。PknG是结核分枝杆菌基因组编码的11个真核细胞样丝氨酸/苏氨酸激酶之一(从PknA到PknL)。它是一个多功能域蛋白，在保守的激酶催化活性功能域两端分别有未知功能的C端和N端功能域。N端序列包含自身磷酸化位点和一个红素氧还蛋白样结构域(rubredoxin-like domain，Rbx)，其激酶活性以及自磷酸化对于分枝杆菌在巨噬细胞中的存活有重要作用。此外，如果对PknG进行基因水平的阻断或者使用化合物对其活性进行抑制，会导致含有结核分枝杆菌的吞噬小体和溶酶体的融合，进而杀伤巨噬细胞内的病原菌。但是，PknG的底物尚未被发现;PknG具体通过何种途径阻断吞噬小体与溶酶体的融合，进而影响分枝杆菌在巨噬细胞内的存活，机制尚不清楚。
　　PknG通过何种方式分泌至细菌体外，从而在巨噬细胞细胞质中阻断吞噬小体与溶酶体的融合是另一个值得研究的问题。分枝杆菌拥有不同的蛋白分泌系统，包括SecA附属分泌系统SecA2。通过对海分枝杆菌野生型和secA2突变株细胞表面成分进行蛋白质组学的分析，我们发现PknG在两种菌株细胞表面的分布有明显变化。此外，secA2突变株存在许多与pknG突变株相似的表型，包括吞噬小体的成熟，代谢变化以及在斑马鱼胚胎模型中肉芽肿形成能力减弱。但是，PknG与SecA2之间的相互关系以及对海分枝杆菌毒力的影响仍需要进一步的研究。
　　为了研究在巨噬细胞中过表达的PknG是否足够回补pknG敲除株中PknG的功能，从而阻止细菌被转移至溶酶体中被清除，我们在鼠源的J774巨噬细胞系中采用以质粒为基础的手段过表达了PknG。在此基础上，我们采用共聚焦显微镜和细菌侵染细胞计数(CFUs)的方法研究了pknG敲除株在过表达PknG的巨噬细胞中存活的状况。结果显示在巨噬细胞中外源表达的PknG能够完全回补海分枝杆菌pknG基因缺失所造成的毒力减弱。我们的研究对PknG在阻断吞噬小体和溶酶体的融合，进而促进病原菌在宿主体内存活的机制提供了更深刻的认识。此外，为了研究PknG与SecA2之间的相互关系以及对海分枝杆菌毒力的影响，我们用secA2突变株对外源性过表达了PknG的巨噬细胞进行侵染，利用共聚焦显微镜对侵染结果进行分析，结果显示在巨噬细胞中过表达的PknG能够部分回补SecA2的毒力，从而进一步阐明了PknG与SecA2分泌系统的关系（论文第二章）。
　　转录组的研究对于揭示基因表达以及转录水平复杂的调控具有重要作用。RNA测序(RNA-seq)是用于转录组分析的一个强大工具，它采用深度测序技术直接确定cDNA序列。海分枝杆菌是研究结核分枝杆菌致病机制的有效模型，在本研究中，我们利用RNA-seq对海分枝杆菌的转录组进行分析。在使用物理方法去除核糖体RNA(rRNA)后，我们获得了海分枝杆菌对数生长期以及平台早期两套转录组数据。在此基础上，我们系统性地描述了两个时期间差异化表达的基因及其功能分类。此外，我们还在全基因组范围内预测了360个共转录单元(operon)，并且我们随机选取了17个预测的共转录单元进行RT-PCR验证，其中13个存在共转录现象。总的来说，我们的研究初步揭示了海分枝杆菌的转录组，这对阐明结核分枝杆菌在转录水平的调控及其致病机制具有借鉴意义。

目录

声明

摘要

第一章 海分枝杆菌无机磷酸盐转运调控蛋白PhoY2功能学与调控机制研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第二章 结核分枝杆菌毒力因子PknG与SecA2分泌系统的相互作用

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第三章 海分枝杆菌转录组研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

(一)在校期间学术交流情况

(二)论文发表情况

(三)博士在读期间所获奖励

(四)获得资助和项目承担情况

致谢