人脐带间充质干细胞激活急性肝衰竭大鼠卵圆细胞增殖中Wnt/β-Catenin信号表达研究

摘要

目的:
　　通过造模成功的急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)大鼠尾静脉注射人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)和生理盐水的对比研究，明确两组急性肝衰竭大鼠肝功能、病理学、卵圆细胞(ovalcell)的活化与增殖以及Wnt/β-Catenin信号通路的表达差异。揭示人脐带间充质干细胞移植可启动急性肝衰竭大鼠肝细胞再生的发生及可能机制，为hUCMSCs临床治疗应用提供理论依据。
　　方法:
　　1、腹腔注射D-氨基半乳糖(D-galactosamine，Gal-N)0.9g/kg诱导大鼠急性肝功能衰竭。造模后24小时经尾静脉移植2×106 hUCMSCs作为移植hUCMSCs组，同时将另一组造模后24小时的大鼠尾静脉注射同等容量的0.9％氯化钠溶液作为对照组。分别检测两组ALT和AST水平，比较两组肝脏组织病理学改变及死亡率。
　　2、利用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术检测移植hUCMSCs组、移植对照组移植1、3、5、10天后卵圆细胞标记EpCAM、CK19，观察各时间点卵圆细胞活化与增殖情况，比较两组卵圆细胞增殖数量差异。
　　3、利用实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)技术检测移植hUCMSCs组、移植对照组肝组织中Wnt/β-catenin信号通路相关基因Wnt2、Wnt7a、Wnt7b和EpCAM的相对表达量。利用IHC、免疫荧光(immunofluorescence，IF)技术检测两组β-catenin的表达情况。
　　结果:
　　1、肝功能生化结果显示移植hUCMSCs组比移植对照组在移植后24、48h时ALT和AST显著降低(P＜0.05)。苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色)结果显示移植hUCMSCs组比移植对照组肝损伤轻，肝脏再生修复明显，病理分级差异有统计学意义(T=32.5，P＜0.01)。生存分析显示移植hUCMSCs组的死亡率比移植对照组显著降低。
　　2、IHC检测显示移植hUCMSCs组的卵圆细胞活化与增殖在移植后第5天达到高峰，并向肝实质延伸，且与移植对照组相比明显增多，差异有统计学意义(t=9.1531,P＜0.01)。
　　3、qRT-PCR检测显示移植hUCMSCs组在移植后24小时肝组织中Wnt/β-catenin信号通路相关基因Wnt2、Wnt7a、Wnt7b和EpCAM的mRNA表达分别为移植对照组的2.4倍(t=3.950，P=0.0168)，3.1倍(t=4.846，P=0.0084)，3.0倍(t=2.888，P=0.0447)，1.7倍(t=3.219，P=0.0323)。IHC和IF检测显示β-catenin主要在活化的卵圆细胞的胞浆和胞核中聚集，且移植hUCMSCs组较移植对照组增多。
　　结论:
　　hUCMSCs移植入急性肝衰竭大鼠可以显著改善肝功能，减轻肝脏病理损伤程度，促进肝脏再生，降低死亡率。其机制可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路，诱导卵圆细胞活化增殖，从而发挥促进肝脏再生的作用。

目录

中英文缩略语对照

摘要

第一章 前言

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验细胞

2．1．3 主要实验仪器

2．1．4 主要试剂

2．1．5 实验试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 动物模型建立

2．2．2 模型动物分组与处理

2．2．3 评估hUCMSCs移植与对照组治疗大鼠急性肝衰竭的疗效

2．2．4 IHC检测各组卵圆细胞活化、增殖情况

2．2．5 qRT-PCR、IHC及IF检测Wnt／β-catenin信号表达情况

2．2．6 统计学分析

2．2．7 技术路线图

第三章 结果

3．1 急性肝衰竭大鼠造模成功的标志

3．2 hUCMSCs移植治疗与对照组对急性肝衰竭疗效评价

3．2．1 急性肝衰竭大鼠肝功能生化指标动态变化及死亡率比较

3．2．2 急性肝衰竭大鼠肝组织病理学改变

3．3 不同干预组卵圆细胞活化、增殖变化

3．4 不同干预组Wnt／β-Catenin信号通路变化

3．4．1 Wnt2、Wnt7a、Wnt7b和EpCAM基因表达变化

3．4．2 β-catenin在细胞中的分布变化

第四章 讨论

第五章 全文结论

参考文献

综述 人脐带间充质干细胞在肝病治疗中的研究与应用

致谢

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