胰腺导管腺癌lncRNAs差异表达谱的筛选及功能分析

摘要

本文从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 胰腺导管腺癌lncRNAs差异表达谱的筛选及验证
　　目的：研究lncRNAs在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达特征，预测差异表达lncRNAs在胰腺癌组织中基因异常表达的调控作用。
　　方法：采用Human LncRNAArray v2.0(8×60 K，Arraystar)芯片对6对胰腺癌组织及癌旁组织标本中的转录本进行高通量筛查，确定胰腺癌中的lncRNAs和mRNAs差异表达谱。然后采用qPCR在61例胰腺导管腺癌、20例胰腺浆液性囊腺瘤、14例实性假乳头状瘤、10例神经内分泌瘤及12例十二指肠乳头腺癌的癌组织和癌旁组织中对5个差异表达的lncRNAs，AC09011013.1、CXCR2P1、PPY2、HOXA11-86、DKFZp434J0226进行验证。采用GO、Pathway及编码非编码基因共表达网络等生物信息学方法对差异表达mRNAs的功能及差异表达lncRNAs对胰腺癌组织中基因异常表达的调控作用进行分析，并为进一步的研究奠定基础。
　　结果：芯片杂交数据分析显示，在6对胰腺癌组织和癌旁组织之间，表达差异倍数＞2，p≤0.05的lncRNAs有291个，其中上调的53个，下调的76个。聚类分析显示，291个差异表达的lncRNAs能够区分癌组织和癌旁组织。其中91个lncRNAs在6对标本中的变化与总体结果一致，其中34个上调，57个下调，显示了较高的特异性。在61对胰腺癌组织和癌旁组织中用qPCR检测了5个lncRNAs, AC09011013.1、CXCR2P1、PPY2、HOXA11-86、DKFZp434J0226表达情况，验证了芯片结果的可靠性。AC09011013.1、DKFZp434J0226在胰腺癌组织中的表达差异具有特异性;HOXA11-86在除实性假乳头状瘤外的其他三类非胰腺癌肿瘤组织中的表达也显著升高;PPY2在神经内分泌肿瘤组织中显著升高、CXCR2P1在浆液性囊腺瘤组织中显著降低。
　　在6对胰腺癌组织及癌旁组织中检测到222个蛋白编码基因存在显著表达差异，其中上调的66个，下调的156个。GO分析显示，上调的66个基因涉及到的主要生物过程是“营养过度应答(response to dietary excess)”，细胞成分是“核小体(nuclesome)”，分子功能是“二磷酸尿苷-半乳糖转移酶活性(UDP-galactosyltransferase activity)”;156个下调的基因所涉及的生物过程是“免疫系统进程(immune system process)”，细胞成分是“细胞外区域(extracellularregion)”，分子功能是“趋化因子受体结合(chemokine receptor binding)”。Pathway分析显示差异表达的基因主要分布在粘多糖合成及硫酸角质素相关的（glycosaminoglycan biosynthesis-keratan sulfate）糖基复合物代谢通路中及金黄色葡糖球菌感染相关的信号调节通路中。编码和非编码RNA共表达调控网络分析显示AC091013.1、CXCR2P1和DKFZp434J0226具有更多的相关基因。而HOXA11-86和PPY2相关基因数较少。
　　结论：在胰腺癌组织及癌旁组织中存在lncRNAs和mRNAs表达差异。差异表达的蛋白编码基因主要集中在和细胞代谢、免疫生物过程，与核小体及细胞外区域密切相关，涉及趋化因子结合及UDP-半乳糖转移酶等分子功能。长链非编码RNA-AC091013.1和DKFZp434J0226在胰腺癌组织中的表达差异具有特异性，并且具有更多的相关基因，可能具有更重要的功能。
　　第二部分 胰腺导管腺癌差异表达lncRNAs的临床意义
　　目的：评价AC091013.1和DKFZp434J0226和胰腺癌临床病理参数之间的关系，以及对临床预后的判断价值。
　　方法：选取符合入组条件的胰腺癌病例109例，用qPCR的方法检测AC091013.1和DKFZp434J0226在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达情况，结合临床病理参数及预后资料进行统计分析。分别使用方差分析、chi-squared检验及双侧T检验对数据进行统计分析。危险因素的估计使用logistic回归的方法。Kaplan-Meier及log-rank分析用于胰腺癌病人生存率统计及比较。胰腺癌病人预后因素的检测使用COX回归的方法。
　　结果：全组109例胰腺癌病例，中位无瘤生存时间(DFS)是324天，中位总生存时间(OS)是370天。Log-rank检验发现TNM分期(x2=9.486，P=0.002)、肿瘤大小(x2=8.738，P=0003)和淋巴结转移(x2=7.152，P=0.028)及年龄(x2=5.975，P=0.015)影响患者的无瘤生存时间;TNM分期(x2=6.741，P=0.009)、淋巴结转移(x2=5.322，P=0..21)及年龄(x2=6.684，P=0.010)影响患者的总生存时间。 COX模型分析影响患者OS的预后因素，发现年龄和淋巴结转是预测死亡的独立因子。
　　109例胰腺导管腺癌病例中AC091013.1高表达的56个，低表达的53个。单因素卡方检验显示两组在性别（x2=5.814，P=0.016）和血管受侵犯(x2=5.58，P=0.018)的比例上有显著差异。多因素logistic回归分析也显示性别和血管浸润和AC091013.1的表达相关。并且性别和血管浸润是AC091013.1表达高低的独立危险因素（性别:OR=0.337，P=0.009;血管浸润:OR=0.290，P=0.011）。 Log-rank检验发现:AC091013.1高表达组和低表达组之间无论是在无瘤生存时间、还是在总生存时间上差异都不具有统计学意义。109例胰腺导管腺癌病例中DKFZp434J0226高表达的54个，低表达的55个。单因素卡方检验显示两组在肿瘤分化(x2=8.363，P=0.015)、神经浸润(x2=16.048，P=0.001)和TNM分期(x2=3.993，P=0.046)的构成比例上有显著差异。多因素二元logistic回归分析也显示神经浸润和DKFZp434J0226的表达呈正相关，并且是DKFZp434J0226表达高低的独立危险因素（OR=5.963，P＜0.001）。
　　进一步log-rank检验发现DKFZp434J0226低表达组无论是无瘤生存时间还是总生存时间均显著优于高表达组（DFS:低表达组VS高表达组为388.000±15.889 vs280±25.107，x2=6.701，P=0.010;OS:低表达组VS高表达组为416.000±14.830 vs320±12.247,x2=8.734,P=0.003)COX模型分析显示DKFZp434J0226是胰腺癌复发转移和死亡的独立预测因子(DFS∶ OR=1.68, P=0.037; OS: OR=1.891, P=0.009), DKFZp434J0226高表达组比低表达组复发转移的风险高1.68倍，死亡风险高1.891倍。
　　结论：长链非编码RNA-AC091013.1在胰腺癌组织中表达的高低和性别及血管侵犯相关，但对胰腺癌患者的无瘤生存期和总生存期无影响。长链非编码RNA-DKFZp434J0226与神经浸润显著相关;DKFZp434J0226低表达组无论是无瘤生存期还是总生存期均显著优于高表达组;COX模型分析显示DKFZp434J0226是胰腺癌复发转移和死亡的独立预测因子。DKFZp434J0226高表达组比低表达组复发转移的风险高1.68倍，死亡风险高1.891倍。
　　第三部分 LncRNA-DKFZp434J0226在胰腺癌细胞侵袭能力的影响
　　目的：研究长链非编码RNA-DKFZp434J0226对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响，及其分子机制。
　　方法：先用qPCR的方法检测lncRNA-DKFZp434J0226在MIAPaCa-2、Capan-1和PANC-1胰腺癌细胞株中的表达情况，将表达最高的细胞株选定为研究对象。同时构建DKFZp434J0226敲除的稳转细胞株。用划痕试验和Transwell侵袭实验比较基因敲除后细胞迁移、侵袭能力的变化。再用qPCR和Western blot的方法检测MMP-9和VEGF的表达变化。
　　结果：在MIAPaCa-2、Capan-1和PANC-1三株细胞中，DKFZp434J0226在MIAPaCa-2中的表达最高。构建lncRNA-shRNA敲除稳转细胞株中DKFZp434J0226表达显著下调超过90％。划痕试验及Transwell侵袭实验提示DKFZp434J0226敲除以后细胞的迁移及侵袭能力显著降低。QPCR和western blot显示细胞内MMP-9和VEGF的表达水平显著降低。
　　结论：在MIAPaCa-2细胞中敲除DKFZp434J0226后可以抑制细胞的侵袭迁移能力，其机制可能与下调细胞内MMP-9和VEGF的水平有关。

目录

摘要

中英文缩略词表

引言

参考文献

第一部分 胰腺导管腺癌IncRNAs差异表达谱的筛选及验证

前言

摘要

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 胰腺导管腺癌差异表达IncRNAs临床价值

前言

摘要

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 LncRNA-DKFZp434J0226对胰腺癌细胞侵袭能力的影响

前言

摘要

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

综述 长链非编码RNA在消化道肿瘤中的研究进展

在读期间发表的论文

致谢

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