DLBCL中PI3K催化亚单位异常及其在AKT活化中作用的研究

摘要

本文从以下四方面进行了议论：
　　第一部分 DLBCL中PI3K/AKT亚单位的拷贝数变异及其临床病理意义
　　目的:研究弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)中PI3K/AKT活化的机制以及其临床病理相关性，从PI3K/AKT亚单位拷贝数变异(copy number variation，CNV)的角度阐述DLBCL的发病机理，以期为DLBCL的诊断以及预后评估提供新的分子指标。
　　方法:收集复旦大学附属肿瘤医院病理科2005年-2011年间新鲜DLBCL组织标本60例，其中57例收集到随访资料;同时收集淋巴组织反应性增生(reactivehyperplasia，RH)10例作为对照。利用高通量NanoString nCounter技术同时检测PI3K/AKT通路中12个基因的拷贝数变异(CNV)，包括PI3K主要的催化亚单位和调节亚单位以及其下游AKT的亚单位，分析其与DLBCL临床病理参数和预后的关系。
　　结果:(1)利用NanoString nCounter技术检测PI3K主要的催化亚单位和调节亚单位以及其下游AKT的亚单位，包括PIK3CA，PIK3CB，PIK3CD，PIK3CG，PIK3C2A, PIK3C2B, PIK3C2G, PIK3R1, PIK3R2, AKT1, AKT2, AKT3。除了PIK3R1，所有PI3K和AKT的亚单位均检测到拷贝数的扩增和缺失，变异率从8.3％-20.0％不等。其中大部分基因为拷贝数扩增，扩增比例占发生拷贝数变异的64％-100％，只有PIK3CD以拷贝数缺失为主，占拷贝数变异的70％。PI3K/AKT通路中发生拷贝数变异的频率达到58.3％。(2)同时在DLBCL和BL细胞系中检测发现DOHH2，LY1，LY8和Toledo均存在拷贝数扩增。(3)PIK3 CA，PIK3CB，PIK3CD和PIK3CG的CNV与临床病理指标，年龄、性别、临床分期、IPI、大块病变、B症状和乳酸脱氢酶水平无明显的相关性(P＞0.05）。其中PIK3CA和PIK3CB基因的CNVs与总生存期短密切相关(分别是P=0.029和P=0.019)。
　　结论:PI3K/AKT通路各亚单位CNV在DLBCL的发生中可能起重要作用，并可能是AKT信号通路活化的原因。PIK3CA和PIK3CB的拷贝数扩增对于预测DLBCL的预后具有重要意义。
　　第二部分 DLBCL中p110催化亚单位和pAKT的表达及其临床病理意义
　　目的:PI3K/AKT信号通路在DLBCL中发挥重要作用，已经证实该信号通路的基因存在拷贝数变异，但是与蛋白表达之间的关系还不清楚。通过研究DLBCL中PI3K亚单位的表达初步探讨PI3K/AKT通路活化的机制，以期为DLBCL的诊断以及预后评估提供新的分子指标。
　　方法:收集复旦大学附属肿瘤医院病理科2005年-2011年间新鲜DLBCL组织对应石蜡标本60例，其中57例收集到随访资料;同时收集淋巴组织反应性增生(reactive hyperplasia, RH)10例作为对照。用免疫组织化学方法（immunohistochemistry, IHC）检测p110α，p110β，p110γ，p110δδ和pAKT的表达。
　　结果:(1)在DLBCL组织芯片中检测p110α，p110β，p110γ，p110δ和pAKT表达发现，在RH中生发中心内外均可见散在分布的阳性表达的淋巴细胞，在DLBCL中呈不同程度的弥漫阳性表达。阳性表达率分别是80％、81.6％、81.6％、81.6％和75％，强阳性表达率是26.7％、25.0％、18.3％、25.0％和16.7％。(2)除了p110δ的强阳性表达与DLBCL的低IPI分期有关外，其他亚单位的表达与其他临床病理指标，年龄、性别、临床分期、IPI、大块病变、B症状、乳酸脱氢酶水平和病理分型，各组间均无显著差异(P＞0.05)。(3) p110α的强阳性表达与PIK3CA的拷贝数扩增正相关(P=0.003)，pAKT的中强阳性表达与p110α的强阳性表达正相关(P=0.026)。p110α，p110β，p110γ和p110δ的强阳性表达与生存期短密切相关(分别是P=0.022，P=0.015，P=0.015和P=0.008)。pAKT中强阳性组病例的预后较差，经过Log-rank检测，两组间未显示显著性差异(P=0.165)。
　　结论:PI3K亚单位蛋白的异常表达与临床预后密切相关，可以作为监测临床预后的指标。p110α的强阳性表达与pAKT的中强阳性表达密切相关，提示可能在AKT的活化中起重要作用。
　　第三部分 PI3K催化亚单位沉默对AKT活化及细胞生物学行为影响的体外研究
　　目的:通过体外细胞实验探讨干扰PI3K四个催化亚单位的表达是否改变AKT信号传导通路的活化状态，从而影响DLBCL细胞生长及其他生物学效应。
　　方法:利用RNAi技术，以慢病毒为载体，用含有PIK3CA，PIK3CB，PIK3CD和PIK3CG干扰序列的慢病毒和对照空病毒分别感染LY8细胞，采用流式细胞仪筛选含有绿色荧光(GFP)的LY8细胞，建立稳定转染细胞株（稳转株）。用Westernblot检测稳转株细胞中PI3K四个催化亚单位的表达情况，筛选出沉默效果好的的稳转株。用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的发生情况，用CCK8试剂盒检测细胞的增殖情况，绘制生长曲线。用Western blot检测PI3K下游AKT, pAKT以及细胞周期、细胞凋亡相关蛋白的表达情况。
　　结果:四个催化亚单位PIK3CA，PIK3CB，PIK3CD和PIK3CG干扰之后G1期的细胞比例上升[对照组:37.06％(36.56±2.01)％，实验组:51.4％(50.77±1.45)％，40.82％(46.04±5.58)，47.16％(47.12±2.02)和60.40(59.10±1.03)％]，处于S期的细胞比例基本不变[对照组:48.96(46.47±2.34)％，实验组:40.36％02.43±2.57)，49.84(45.83±3.93)％，44.53(44.13±0.83)％和30.90(32.87±2.17)％]，处于G2期的细胞比例下降[对照组:13.98(16.96±2.79)％，实验组:8.23(6.80±1.34)％，9.34(7.91±1.30)％，8.31(9.37±0.96)％和8.68(7.99±2.04)％]。其中PIK3CA，PIK3CD和PIK3CG与对照组相比发生了明显的G0/G1期阻滞，有显著性差异(P＜0.05)。干扰之后各实验组早期凋亡发生率分别为11.5(10.30±1.11)％，9.3(7.83±1.15)％，7.0(6.67±0.35)％和4.7(5.80±1.11)％，对照组为5.7(5.13±0，38)％，发生了明显的早期凋亡，其中PIK3CA，PIK3CB和PIK3CD干扰之后与对照组相比凋亡显著增多，(P＜0.05)。生长曲线显示干扰各组均显示细胞增殖减低，其中PIK3CD组增殖降低最为明显，与对照组相比72和96小时增殖具有显著差异(P＜0.05)。蛋白检测显示各亚单位AKT的表达不变而pAKT的表达明显减低;细胞周期相关蛋白p27表达升高，cyclinD1表达降低;细胞凋亡相关蛋白bcl-2和PARP未见显著改变
　　结论:干扰PI3K催化亚单位的表达均可以导致AKT活性下降，并可以导致周期阻滞和（或）细胞凋亡，干扰各亚单位的表达能够有效抑制DLBCL细胞的增殖，可能有利于选择性抑制剂发挥其抑制肿瘤生长的效应，成为DLBCL靶向治疗的策略之一。
　　第四部分PIK3CD干扰对人DLBCL移植瘤生长影响的初步研究
　　目的:建立DLBCL裸鼠移植瘤模型，通过体内试验探讨干扰PIK3CD的表达对DLBCL细胞生长及其生物学效应的影响。
　　方法:使用无菌套管针抽吸法建立DLBCL裸鼠皮下移植瘤模型，将裸鼠随机分两组，每组10只，即干扰PIK3CD表达LY8稳转株荷瘤鼠为实验组和转染空病毒LY8稳转株荷瘤鼠为对照组，观察两组的成瘤率，组织形态，肿瘤体积，以及细胞凋亡情况。用IHC检测细胞增殖和细胞凋亡相关蛋白的表达;采用流式细胞技术检测肿瘤细胞的细胞凋亡。
　　结果:(1)DLBCL细胞，2周时实验组成瘤率为4/10(40％)，对照组成瘤率为7/10(70％)，对照组成瘤率高于实验组，有显著性差异(P＜0.05)。(2)实验组较对照组肿瘤体积较小，但肿瘤体积无显著性差异(P＞0.05);实验组较对照组裸鼠体重较轻，但裸鼠体重无显著性差异(P＞0.05)。(3)实验组较对照组细胞晚期凋亡率高[对照组:6.5(5.87±0.76)％，实验组:18.1(16.07±1.76)％]，总凋亡率高[对照组:10.0(10.70±1.04)％，实验组:20.8(17.00±1.49)％]，差异均有显著性(P＜0.05)。(4)IHC显示实验组较对照组Ki-67和bcl-2阳性表达率减低。
　　结论:通过人DLBCL裸鼠移植瘤模型，体内研究初步显示干扰PIK3CD的表达可通过促进肿瘤细胞凋亡，在一定程度上抑制肿瘤的生长，为PIK3CD抑制剂应用于DLBCL的治疗提供理论依据。

目录

摘要

前言

参考文献

第—部分 DLBCL中PI3K／AKT亚单位的拷贝数变异及临床病理意义

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 DLBCL中p110催化亚单位和pAKT的表达及其临床意义

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 PI3K催化亚单位沉默对细胞生物学行为影响的体外研究

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第四部分 PIK3CD干扰对人DLBCL移植瘤生长影响的初步研究

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

总结

Ⅰ型PI3K亚单位在肿瘤中的研究进展

英文缩略词表

攻读博士学位期间己发表及待发表的论文题录

致谢

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