基于生物质谱的磷酸化与糖基化蛋白高特异高灵敏分析新方法研究

摘要

翻译后修饰是对蛋白质翻译后进行化学修饰的过程，增加了蛋白质组的复杂性和功能的多样性。翻译后修饰的多样性，使得蛋白质组中蛋白质的数目远远大于基因组的数目。蛋白质的翻译后修饰并不仅仅是个简单的修饰过程，它调节着蛋白质的活性、构象、定位、功能以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用等。蛋白质翻译后修饰几乎涉及所有生物过程，并和众多疾病发生、发展具有重要的联系。因此，翻译后修饰蛋白质组学是当前基于质谱的蛋白质组学的重要研究部分。常见的翻译后修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化、乙酰化等，其中磷酸化和糖基化蛋白质翻译后修饰的研究最为广泛。
　　磷酸化和糖基化蛋白质组学研究中都面临着很多的研究难点，这两类翻译后修饰蛋白质的种类虽然较多，但是它们的丰度通常较低，很容易被一些高丰度的蛋白所掩盖，并且修饰基团的存在也会影响其在质谱检测中的离子化效率。因此要检测这些低丰度的翻译后修饰蛋白，首要任务就是从复杂体系中分离富集出磷酸化或糖基化蛋白/肽段，这也是提高目标磷酸化/糖基化蛋白的质谱检测灵敏度的必要条件。在糖基化蛋白质组学的研究中，除了确定糖蛋白的糖基化位点和糖基化程度外，对糖蛋白质中的糖链进行解析也是糖蛋白组学研究的重要部分。然而，糖链属于非模板合成，结构组成复杂，同时糖链的含量通常较低且在质谱中的离子化效率低，因此在质谱分析中仍存在较多技术瓶颈。为了使糖链能够得到有效的检测，对糖链进行有效的释放，衍生和富集纯化是实现糖链的质谱检测和结构解析的有效手段。
　　本论文以蛋白质组学中的翻译后修饰研究为主题，重点针对翻译后修饰蛋白质组学研究中磷酸化蛋白质和糖基化蛋白质使用质谱分析时所面临的选择性富集和检测灵敏度等热点难点问题，以生物质谱技术为基础，开展了一系列工作。将新型功能化纳米材料应用于磷酸化/糖基化肽段的特异性富集与质谱鉴定研究中，并用实际生物样品验证了这些新方法的可行性。针对糖基化翻译后修饰中的糖链分析研究，发展了化学衍生与富集相结合的方法以及非特异性酶解释放糖链及相应的纯化方法。本论文的主要内容摘要如下:
　　第一章为绪论部分，主要对蛋白质组学，生物质谱技术，翻译后修饰组学和相应的分析策略进行了概述，重点分析了磷酸化蛋白质组学和糖基化蛋白质组学研究中所面临的主要困难，对当前磷酸化和糖基化蛋白/肽段的各种分离富集方法进行了分类和详细阐述，并综述了功能化材料在当前磷酸化和糖基化蛋白/肽段的富集中的应用。同时，针对糖蛋白中糖链分析策略，概述了糖链的释放方法以及糖链的分离纯化方法，然后综述了当前针对糖链进行衍生的主要技术方法。最后，在此基础上，提出了本论文选题的目的和意义。
　　第二章主要介绍了磁性介孔γ-Fe2O3纳米材料应用于磷酸化肽段的富集和质谱鉴定的新方法研究。在磷酸化肽段的富集研究中，一种简单的方式是在磁核表面包裹上一层多孔的亲和材料外壳，可利用外层亲和材料对磷酸化肽段进行富集，同时可通过磁力分离简化富集流程中的分离操作。在本章中，我们基于二合一的策略，设计采用磁性介孔铁氧化物材料富集磷酸化肽段，并最终制备了磁性介孔γ-Fe2O3材料(m-γ-Fe2O3)，该材料具有均一的介孔结构(9.7 nm)，高的比表面积(117.8 m2/g)以及高的磁响应性(Ms=78.8 emu/g)。高的比表面积可以增加材料与磷酸化肽段的特异性相互作用以及对磷酸化肽段的富集容量，与磁核表面包覆非磁性亲和壳层的核壳材料相比，m-γ-Fe2O3材料具有更高的磁响应性，高的磁响应性保证了材料可以从溶液中快速分离（利用磁铁可以在5s内将材料从溶液中分离），从而将磷酸化肽段的富集功能与快速分离能力相结合。利用以上特性，将m-γ-Fe2O3材料应用于复杂肽段混合物中磷酸化肽段的快速富集，显示了高的选择性（100∶1，摩尔比），高的灵敏度(50 fmol)，高的回收率(89.4％)。在实际的牛奶样品应用中，也显示了很好的磷酸化肽段富集选择性。m-γ-Fe2O3材料集快速分离与磷酸化富集功能于一种单一结构中，且合成方法简单，利用实现商业化，对于其实际应用也显示了很大潜力。
　　第三章主要介绍了磁性纳米核壳材料MCNC@PMAA@Ag-NPs应用于糖基化肽段富集和质谱鉴定的新方法研究。以磁性纳米晶簇(MCNC)作为磁核保证了高的磁响应性，借助磁铁即可以方便、快速的将材料从溶液中分离出来。以相对亲水的聚甲基丙烯酸(PMAA)聚合物作为中间壳层，可以减少富集过程中蛋白或者肽段的非特异吸附。此外，PMAA聚合物层提供了大量的羧基，促进了表面大量Ag纳米颗粒的沉淀，最后我们利用材料表面沉积的高覆盖度的Ag纳米颗粒实现了糖基化肽段的富集。将MCNC@PMAA@Ag-NPs复合纳米功能材料应用于标准蛋白酶解肽段混合物中，利用外层Ag纳米颗粒与糖链之间的相互作用以及磁核的高磁响应性，实现了糖基化肽段的高选择性、快速富集，选择性高达100∶1（摩尔比），富集时间仅为1分钟。同时，将该材料应用于实际生物样本大鼠血清中，从1μL的大鼠血清中共鉴定到了127条特异性糖基化肽段，归属于51个糖蛋白。实验结果显示，MCNC@PMAA@Ag-NPs复合纳米功能材料在复杂的生物样品应用中显示高的富集选择性以及快速分离能力，具有很好的应用潜能。
　　第四章主要介绍了高氟化试剂衍生结合氟固相萃取用于糖链衍生和富集的新方法研究。在本章工作中，我们发展了一种新的糖链衍生与富集方法，利用高氟化试剂的衍生提高糖链在质谱检测中的信号响应，同时利用氟固相萃取(FSPE)实现糖链的有效分离纯化。首次报道了通过高氟化标签的引入，将糖链的衍生和富集相结合用于糖链的质谱分析。一方面，高氟化标签的引入可以增加糖链的疏水性，使得衍生后糖链在质谱中的信号响应明显增加，标准糖链的测试结果显示信号增强了30-40倍。另一方面，对高氟化标签具有特异亲和性的FSPE可用于低丰度糖链（低至0.1fmol/μL）的富集和除盐（饱和NaCl和NH4HCO3盐溶液以及2M尿素溶液），显示了高的富集能力和抗污染物干扰能力。同时，FSPE可用于蛋白混合溶液中糖链的富集纯化，富集效果优于商业化的石墨化碳纯化糖链的方法。基于以上特性，将糖链衍生和FSPE富集相结合的方法直接应用于糖蛋白中的糖链分析，使用PNGase F释放糖链后的混合溶液，不经过传统的糖链纯化步骤，直接进行高氟试剂的衍生标记，再使用氟固相萃取纯化糖链，从而实现对糖蛋白上的糖链的质谱分析。
　　第五章主要介绍了Pronase E酶解释放糖蛋白中的糖链及相应的糖链纯化方法的研究工作。本章工作中，我们使用非特异性酶Pronase E对糖蛋白进行酶解释放糖链，糖链结合处的肽段经非特异性酶Pronase E酶解后，将转变为含有几个氨基酸的寡糖肽或者单个氨基酸的糖氨酸，我们重点考察了如何对酶解混合物中的寡糖肽或糖氨酸进行有效的富集纯化。结果显示只使用多孔石墨化碳(PGC)固相萃取的方法无法从复杂混合体系中获得寡糖肽或糖氨酸，而通过Sep-PakC18固相萃取与PGC固相萃取相结合的方式可以实现寡糖肽或糖氨酸有效的分离纯化。同时，对酶解条件进行优化后，结果显示在酶与糖蛋白比例4∶1，酶解时间48h，或者酶与糖蛋白比例8∶1，酶解时间24h两种条件下，均可以实现酶解得到只带一个天冬酰胺的糖氨酸(Asn-glycan)。Pronase E酶解方法提供了一种新的糖链释放方法，酶解得到的糖氨酸可用于后续的糖链解析或进行衍生化标记，从而实现糖链的高灵敏度定性或定量分析。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 蛋白质组学与翻译后修饰蛋白质组学研究概述

1．1．1 蛋白质组学

1．1．2 生物质谱技术与蛋白质组学

1．1．3 翻译后修饰蛋白质组学

1．1．4 翻译后修饰蛋白质组的质谱分析策略

1．2 磷酸化翻译后修饰蛋白质组学

1．2．1 磷酸化蛋白质组学概述

1．2．2 磷酸化蛋白／肽段的主要分离富集方法

1．2．3 纳米功能材料用于磷酸化蛋白／肽段的分离富集

1．3 糖基化翻译后修饰蛋白质组学

1．3．1 糖基化蛋白质组学概述

1．3．2 糖基化蛋白／肽段的主要分离富集方法

1．3．3 功能化材料用于糖基化蛋白／肽段的分离富集

1．3．4 糖基化蛋白质组学中糖链的研究策略

1．4 本论文的选题意义

参考文献

第二章 基于磁性介孔γ-Fe2O3纳米材料在磷酸化肽段的富集研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 原料和试剂

2．2．2 磁性介孔γ-Fe2O3的制备

2．2．3 材料表征手段

2．2．4 样品制备

2．2．5 磁性介孔γ-Fe2O3用于磷酸化肽段的富集

2．2．6 MALDI-TOF MS分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 磁性介孔γ-Fe2O3材料的设计与材料表征

2．3．2 m-γ-Fe2O3用于磷酸化肽段富集的条件优化

2．3．3 m-γ-Fe2O3用于复杂肽段混合物中磷酸化肽段的富集

2．3．4 m-γ-Fe2O3富集磷酸化肽段的富集灵敏度、回收率以及富集容量

2．3．4 m-γ-Fe2O3富集牛奶样品酶解液中的磷酸化肽段

2．4 本章小结

参考文献

第三章 基于磁性纳米核壳材料MCNC@PMAA@Ag-NPs在糖基化肽段的富集研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 原料和试剂

3．2．2 磁性复合纳米材料MCNC@PMAA@Ag-NPs的制备

3．2．3 材料表征手段

3．2．4 样品制备

3．2．5 磁性复合纳米材料MCNC@PMAA@Ag-NPs用于糖基化肽段的富集

3．2．6 MALDI-TOF MS分析

3．2．7 纳升液相色谱-串联质谱联用(Nano-LC-ESI-MS／MS)分析

3．2．8 数据库搜索和数据分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 磁性复合纳米材料MCNC@PMAA@Ag-NPs的设计与材料表征

3．3．2 MCNC@PMAA@Ag-NPs用于糖基化肽段富集的条件优化

3．3．3 MCNC@PMAA@Ag-NPs用于复杂肽段混合物中糖基化肽段的富集

3．3．4 MCNC@PMAA@Ag-NPs材料富集糖基化肽段的灵敏度和富集容量

3．3．5 MCNC@PMAA@Ag-NPs材料富集大鼠血清样品酶解液中的糖基化肽段

3．4 本章小结

参考文献

第四章 高氟化试剂衍生结合氟固相萃取用于糖链衍生和富集的分析研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 原料和试剂

4．2．2 样品制备

4．2．3 糖链的高氟化试剂衍生反应

4．2．4 氟固相萃取(FSPE)与石墨化碳固相萃取

4．2．5 MALDI-TOF MS分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 糖链的C8F17功能化胺基试剂衍生反应

4．3．2 氟固相萃取(FSPE)用于低丰度高氟化衍生糖链的富集

4．3．3 FSPE用于高浓度盐溶液中高氟化衍生糖链的富集

4．3．4 FSPE用于蛋白混合溶液中高氟化衍生糖链的富集

4．3．4 糖蛋白中糖链的直接全氟化衍生与FSPE分离富集

4．4 本章小结

参考文献

第五章 基于Pronase E酶解释放糖蛋白糖链及糖链纯化方法的研究

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 原料和试剂

5．2．2 酶解反应

5．2．3 固相萃取纯化糖基化肽段／糖链

5．2．4 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析

5．2．5 MALDI-TOF质谱分析

5．3 结果与讨论

5．3．1 Pronase E酶解

5．3．2 糖蛋白经Pronase E酶解后糖基化肽段／糖氨酸的纯化

5．3．2 Pronase E酶解糖蛋白条件的优化

5．3．4 Pronase E酶解糖蛋白ovalbumin

5．4 本章小结

参考文献

文章发表情况

致谢