新生儿持续肺动脉高压遗传病因及血清标志物初步研究

摘要

新生儿持续肺动脉高压(PPHN)是指出生后胎儿型循环向成人型循环过渡时发生障碍，肺血管压力持续增高并超过体循环动脉压，引起心房和（或）动脉导管水平血液右向左分流，临床出现严重低氧血症甚至死亡的一种疾病。
　　国内外成人及儿童研究显示:家族性、特发性和先天性心脏病相关性肺动脉高压(PAH)与BMPR2、ALK1等基因突变有关。另有报道指出CPS1、ABCA3、CRHR1基因变异以及表观遗传可能参与PPHN的发生。
　　PAH的临床研究认为，肺血管的收缩和舒张受血管活性因子调节，其中比较重要的有一氧化氮(NO)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、内皮素（ET-1）。有研究提示，上述因子合成相关基因NOS3、VEGFA、ACE、EDN1、突变或多态性和相应血清因子浓度存在一定的关联性。
　　既往认为PPHN病因主要包括:宫内慢性缺氧或围生期窒息，宫内或生后感染，呼吸窘迫综合征和胎粪吸入综合征等肺实质性疾病，肺发育不良和先天性膈疝等。近年来遗传因素在PPHN中所起的作用日益受到关注，NOS3、EDN1、ACE、VEGFA基因突变或多态性是否与PPHN易感性有关？而上述基因变异是否导致了血管活性因子浓度的改变？
　　本研究旨在探索NOS3、EDN1、ACE、VEGFA基因变异和PPHN易感性的关系并试图寻找基因变异对相应血清因子浓度的影响。
　　第一部分 ACE、EDN1、VEGFA、NOS3基因多态性和新生儿持续肺动脉高压易感性研究
　　目的:探索PPHN患儿是否存在ACE、EDN1、VEGFA、NOS3基因突变，或者是否存在相关SNP和PPHN易感性有关。
　　方法:在2013年1月至2014年1月期间，收集复旦大学附属儿科医院NICU中因为呼吸窘迫需辅助通气患儿血标本，纳入对象符合PPHN诊断条件为PPHN组，余为非PPHN组，提取DNA，预实验利用Ion Torrent Ampliseq panel技术检测两组新生儿ACE、EDN1、VEGFA、NOS3基因编码区有无突变，比较PPHN组和非PPHN组相关基因多态性位点基因型和等位基因频率有无差异。发现阳性位点后进一步扩大样本量Sanger测序法验证。
　　结果:共收集PPHN组55例，非PPHN组27例，两组患儿在性别构成、出生体重、纳入时间上差异无统计学意义，而在胎龄上，非PPHN组略小。预实验完成Ion Torrent测序30例，包括PPHN组20例，非PPHN组10例。Ion Torrent检测未发现上述基因突变，共发现SNP49个。其中EDN1基因多态性位点rs5370、rs2070699、rs1800543基因型及等位基因频率在两组中差异具有统计学意义。就上述3个SNP位点进一步扩大样本量验证后发现，EDN1 rs2070699基因型频率和等位基因频率在PPHN和非PPHN组间差异仍然有统计学意义，PPHN组TT基因型频率(30.9％)显著高于非PPHN组(11.1％)，x2=7.2，P=0.003，OR值:3.58，95％CI:0.882-20.783。PPHN组T等位基因频率(54.5％)显著高于非PPHN组(31.5％), x2=7.75,P=0.005, OR值:7.00,95％CI:1.820-29.493。
　　结论:EDN1 rs2070699可能和PPHN易感性有关，T等位基因在缺氧时能增加PPHN的发病风险。
　　第二部分 新生儿持续肺动脉高压患儿血清ET-1、VEGF、NO和ACE浓度变化
　　目的:探讨PPHN血管活性因子浓度变化，并寻找ET-1浓度改变和EDN1基因变异之间可能的关联。
　　方法:在2013年7月至2014年1月期间，收集复旦大学附属儿科医院NICU中因为呼吸窘迫需辅助通气患儿血标本，纳入对象符合PPHN诊断条件为PPHN组，余为非PPHN组，选择同时期入住普通新生儿病房的无心肺疾病的黄疸或咽下综合征新生儿作为正常对照组。应用酶联免疫法检测血清ET-1、ACE、VEGF浓度，比色法间接测定NO浓度。
　　结果:共检测PPHN组25例，非PPHN组13例，正常对照组20例。三组胎龄、体重和日龄差异无统计学意义。VEGF[(472.3±360.9)、(783.1±312.9)、(826.2±528.3) pg/mL]和ET-1[(2.8±2.5)、(1.9±1.3)、(0.7±0.9) pg/mL]在三组中的浓度差异有统计学意义（x2=8.12，P=0.02;x2=21.72，P=0.00）ACE和NO在三组间的浓度差异无统计学章义（x2=1.09，P=0.58; x2=3.82，P=0.15）。EDN1 rs2070699位点T等位基因可能为PPHN的危险因素，故将GT型和TT型合并为一大类，与GG型患儿ET-1浓度作比较，共32例患儿同时完成EDN1和ET-1检测，其中基因型为GG型11例，ET-1浓度1.36±0.93 pg/mL，GT+TT型患儿21例，ET-1浓度3.12±2.64 pg/mL。T等位基因携带者血清ET-1浓度更高，Mann-Whitney检验，U=63.5,P=0.039。
　　结论:PPHN时ET-1和VEGF浓度改变明显。EDN1 rs2070699位点G＞T变异可能引起ET-1浓度升高，增加PPHN易感性。

目录

英文缩写索引

摘要

前言

第一部分 ACE、EDN1、VEGFA、NOS3基因多态性和新生儿持续肺动脉高压易感性研究

1．背景

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

第二部分 新生儿持续肺动脉高压患儿血清ET-1、VEGF、NO和ACE浓度变化

1．背景

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

全文总结

综述 肺动脉高压的遗传学病因研究进展

致谢

硕士期间主要发表和待发表文章

硕士期间参加主要学术活动

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