脱氧胆酰酪氨酸的避孕药效及阴道黏膜刺激研究

摘要

近年来，性传播已经成为全球艾滋病病毒(HIV)传播的主要途径，其中研制兼具避孕和预防AIDS/STDs的双功能外用避孕药特别适合我国国情。脱氧胆酰酪氨酸(deoxycholytyosine，DCT)是在保留胆酸及其衍生物可能的药效基团的基础上，对侧链部位用氨基酸进行了结构修饰，合成了新的胆酸衍生物。本研究通过避孕药效学、杀精机制研究、阴道粘膜刺激性研究，对于DCT的成药性初步进行了有效性和安全性的评价，也初步探讨了DCT作为外用避孕药的杀精机制。
　　避孕药效学研究包括体外杀精试验、体内杀精试验与抗生育避孕试验。体外杀精试验将DCT与人类体外精子充分混合作用，观察精子活率随着DCT浓度及时间的变化，即剂量时间效应试验，并同时得出精子的运动参数的变化情况。然后去除DCT作用观察精子活力恢复情况。结果显示DCT的杀精效果具有明显的剂量-时间效应，对精子运动活力参数和精子运动方式参数均有抑制作用，在去除药物作用后精子活率没有明显改变（P＞0.05）。
　　体内杀精试验和家兔避孕试验选用发情期雌兔60只，随机分成6组，阴道内给药，10min后与生育能力正常的雄兔1∶1进行交配。在交配后5 min、10 min、15 min和20 min从阴道取出精液显微镜下观察精子活动情况。结果显示DCT gel在单次阴道给予12.50 mg和25.00 mg DCT剂量时，交配后5min内均未见活动精子。体内杀精试验约60 min后，上述各组家兔阴道给予同样的受试物，10-15min后再与雄兔进行1∶1交配，记录产仔兔情况，并计算出避孕率。结果显示，中、高剂量组家兔达到100％的抗生育避孕效果。
　　杀精机制研究包括质膜完整性试验、凋亡试验、顶体试验、线粒体试验以及利用扫描电镜观察精子结构等。利用荧光染料SYBR-14/PI与荧光显微镜及流式细胞仪相结合定性和定量观察DCT对精子质膜的影响。结果显示DCT可以明显破坏精子质膜，质膜完整精子在DCT0.25、0.5和1.0 mg/ml时质膜完整精子比率分别为（31.26±8.35）％，（13.26±5.21）％和（0.74±0.93）％，与空白对照组具有明显差别（P＜0.05），且具有明显的剂量效应关系。荧光显微镜结合FITC-PSA/PI双染观察精子顶体影响，结果显示，DCT处理后精子顶体区染色暗淡切不均匀，或者根本没有荧光染色，可见DCT对于精子顶体具有明显的破坏作用。利用荧光染料JC-1与荧光显微镜及流式细胞仪相结合定性和定量观察DCT对精子线粒体膜电位的影响。结果显示，DCT处理后精子线粒体膜电位发生改变，精子尾部绿色荧光强度明显增强。FCM结果显示精子线粒体膜电位随着DCT浓度的升高而逐渐下降，正常线粒体膜电位精子比例与空白对照组有明显的差别(P＜0.05)。凋亡精子检测显示晚期凋亡精子比率在0.25，0.5和1.0mg/ml时，分别是（11.92±1.19）％、（30.09±6.29）％和（75.55±6.30）％，具有明显的剂量依赖性（P＜0.05）。DCT≤0.5 g·L-1引起精子早期凋亡率升高，但是高浓度时却出现降低趋势。电镜结果显示DCT处理后大部分精子的顶体脱失，质膜不完整，被溶解、破坏;尾部出现穿孔甚至断裂。
　　阴道黏膜刺激性试验选用成年雌性小型猪9只，随机分为3组，分别为基质对照组、N-9 jelly组和DCT-gel组。在休情期每天单次阴道给药5ml不同受试物，连续7天，给药前和末次给药后24h、72h收集阴道灌流液，取沉淀细胞用流式细胞仪检测炎症细胞及CD45+细胞比例。末次给药后72h处死动物，切开阴道进行肉眼观察，然后分离出阴道组织，分别用10％福尔马林液固定、包埋、切片，进行病理组织学检查。然后利用免疫组织化学染色检测阴道黏膜CD45表达。结果显示，市售N-9 jelly能引起阴道粘膜组织的炎症反应，而导致CVL液中的细胞总数特别是中性粒细胞及CD45+细胞增多，DCT gel组和基质对照组与N-9jelly明显不同，它们没有引起小型猪CVL液中性粒细胞和CD45+细胞数量上明显的增加。
　　从组织学变化角度，小型猪阴道黏膜组织HE染色显示DCT gel对黏膜上皮层、固有层、血管及周围组织无明显损伤（5.5±2.7），与空白胶组相比无显著性差异（3.3±1.6），远低于N-9 jelly组（20.5±3.5，P＜0.05）;与空白胶组相比，DCT gel组的阴道黏膜CD45表达无显著性差异（P＞0.05），N-9jelly组CD45表达显著增加(P＜0.05)。
　　综上所述，DCT不仅具有较强的体外杀精效能，并且对阴道刺激性较小，具有较好的研发价值和广阔的应用前景。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

第一章 避孕药效学

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第二章 杀精机制研究

一、材料

二、方法

三．结果

四、讨论

第三章 阴道黏膜刺激研究

一、材料与方法

二、方法

三、结果

四、讨论

参考文献

硕士期间发表的文章

流式细胞术在外用避孕药精子功能评估中的应用

致谢

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