中国人遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)大片段异常检测与基因数据分析

摘要

遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)是一种常染色体显性遗传病，是遗传性结直肠癌中最常见的一种疾病，在所有的结直肠癌中约占2-5％。HNPCC与散发性结直肠癌(sporadiccolorectalcancer，SCRC)及家族性腺瘤性息肉病(FamiliarAdenomatous Polyposis，FAP)相比，无论在发病机制、临床特征、治疗方案的选择和随访方案的制定上均不尽相同。为此，区分HNPCC与其他类型的结直肠癌具有重要的临床意义。目前，世界许多国家和地区都制定了一定的HNPCC临床诊断标准，但要确诊HNPCC家系和HNPCC患者，还需要依赖于错配修复(Mismatch Repair, MMR)基因胚系病理性突变的检出。主要致病的MMR基因包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2及MLH3这六种，而其中主要致病突变发生在MLH1和MSH2基因中，在HNPCC相关基因突变中约占90％。但是目前对于MMR基因的筛查大多是针对点突变，而这些检测方法是无法检测出于基因中火片段的缺失或复制的，因此大片段异常在HNPCC家系检测中常常被漏诊。而事实上，有研究报道大片段缺失在MMR基因中并不是小概率事件，在MSH2和MLH1基因中，大片段异常这两个基因的所有胚系突变中约占17％。同时世界各个国家都有报道发现大片段缺失，且缺失比例有所不同。
　　同时，由于MMR基因在引发HNPCC上所起的重要作用，国际上也有一些MMR突变数据库，为研究者提供了分享和获取信息的平台。其中最具权威的是InSiGHT(http://www.insight-group.org/mutations/)数据库，由国际遗传性胃肠道癌症协会(the International Society of Gastrointestinal Hereditary Tumors, Insight)创建并管理。截止2014年3月，InSiGHT数据库已收集遗传性胃肠道肿瘤相关的10个致病基因，其中涉及遗传性非息肉型结直肠癌突变基因MLH1，MLH3，MSH2，MSH6，PMS1和PMS2记录共12628条，占总数的48％，每个基因的记录条数分别为6491、148、5016、1506、1、520。
　　我们的研究主要从两个方面深入研究HNPCC相关的MMR基因。一方面，基于大片段异常的研究现状及我国在这方面研究的欠缺，我们从肿瘤医院结直肠癌肿瘤资源库里选择了60个HNPCC家系，收集各先证者的血样并提取DNA，然后运用荷兰学者Schouten等开发的高通量相对定量DNA拷贝数的技术方法——多重连接依赖的探针扩增反应(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)，来对这些样本DNA进行大片段异常的检测。检测结果显示:60个病人中有10个(16.7％)检测出大片段缺失，其中hMLH1基因缺失的有3个(5％)，16号外显子缺失率最高;hMSH2基因缺失的有7个(11.7％)，其中9号和3号外显子的缺失率较高。通过和点突变检测结果比对以及病人的临床数据，我们可以发现:HNPCC患者多较为年轻，且在判断时不能仅从临床特征、家系信息和符合的临床判断标准就诊断，需要分子检测;而在分子检测时，点突变病人和大片段缺失病人没有重合，如果仅用传统手段（如直接测序）会遗漏大片段缺失的病人，因此在分子检测时建议加上大片段缺失的筛查。
　　另一方面，在InSiGHT数据库中已经积累了大量的MMR基因的研究数据，但少有对这些数据进行大规模统计分析的研究。实验室之前已经基于该数据库对MLH1和MSH2基因进行过统计分析，得出了这两个基因的在黄种人与白种人的突变分布特点，但并没有对MSH6、PMS2和MLH3这三个基因进行研究。因此我们将基于InSiGHT数据库对这几个基因进行数据挖掘，提取相关文献中的关键信息，收集成我们自己的数据库并进行统计分析。结果发现:MSH6、PMS2和MLH3这三个基因，都有自己的高频突变位点和高频外显子，当我们进行临床检测和诊断时，应着重检测这些位点和外显子。另外，尽管亚洲人群只占到了总人数的少数部分，但是仍然有一些比较重要的高频外显子和高频突变位点，如MSH6基因的5号外显子和MLH3基因中的突变位点c.691A＞C，c.2896T＞C和c.2825C＞T，它们的分布和特征都与总人数有所区别，值得重视。对于携带MSH6基因的病人，大多数都不止患病一次，且患病平均年龄（约50岁）比普通的HNPCC病人（约45岁）要晚。在两次患病的病人中，女性患者占了大多数，并且多是既患有结直肠癌，又患有子宫内膜癌。这说明在进行临床检测时，女性的HNPCC患者还要及早预防子宫内膜癌等生殖系统相关的疾病，进行子宫、卵巢等相关器官的检查。

目录

摘要

引言

第一部分 HNPCC病人MMR基因大片段异常的检测

1．1 引言

1．1．1 HNPCC的临床特征

1．1．2 HNPCC临床诊断标准

1．1．3 HNPCC致病机制及大片段缺失相关基因简述

1．1．4 HNPCC大片段缺失的研究现状及方法

1．2 材料与方法

1．2．1 病例收集

1．2．2 主要试剂及仪器

1．2．3 血清DNA的提取与处理

1．2．4 MLPA操作流程

1．3 结果

1．3．1 单个样本的结果分析

1．3．2 所有样本结果统计

1．4 讨论

1．4．1 实验与数据分析方法讨论

1．4．2 样本结果的讨论分析

1．5 总结

第二部分 MSH6、PMS2及MLH3基因已发表数据的统计分析

2．1 引言

2．1．1 数据挖掘与生物信息学介绍

2．1．2 生物信息学手段在HNPCC中的应用

2．1．3 MSH6、PMS2和MLH3基因简介及相关研究

2．2 材料与方法

2．2．1 数据收集

2．2．2 突变类型的确定

2．2．3 患者人种的确定

2．2．4 统计分析

2．3 结果

2．3．1 不同突变类型的突变分布

2．3．2 MSH6，PMS2和MLH3基因的突变热点

2．3．3 对MSH6基因的进一步分析

2．4 讨论

2．5 总结

参考文献

后记

文章发表

附录

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