日本血吸虫入侵宿主过程中关键尾蚴蛋白酶的研究

摘要

血吸虫病是一种由血吸虫侵染人类及其它哺乳动物引起的人畜共患寄生虫病，在我国流行的是日本血吸虫病。目前还没有预防血吸虫病的有效方法，而唯一的有效治疗药物吡喹酮已经出现耐药性，因此亟待开发预防和控制血吸虫病的新方法。
　　目的：血吸虫以尾蚴的形式入侵终宿主，进而对宿主造成严重危害。在侵染过程中，尾蚴分泌的蛋白酶发挥了主要作用，研究血吸虫入侵宿主相关的尾蚴蛋白酶有助于揭示血吸虫侵染宿主分子机制和预防血吸虫病。本文对日本血吸虫入侵宿主相关的尾蚴蛋白酶进行了深入研究。
　　方法：首先对日本血吸虫尾蚴可溶性总蛋白和尾蚴分泌蛋白分别进行质谱分析，筛选其中可能与血吸虫入侵宿主有关的尾蚴蛋白酶;然后对组织蛋白酶B2（SjCB2）、尾蚴弹性蛋白酶(SjCE2b)、钙蛋白酶(Sjcalpain)、金属内肽酶（SjME）、M17家族氨基肽酶(SjM17)、线粒体金属肽酶M16(SjM16)和蛋白酶体β型7亚单位（SjP7）七种日本血吸虫尾蚴蛋白酶基因进行了原核克隆表达及纯化;将纯化的重组蛋白分别免疫新西兰白兔制备兔多克隆抗体并用ELISA检测多克隆抗体的效价;利用免疫荧光定位技术观察SjCB2、SjCE2b和Sjcalpain在尾蚴组织中的分布情况;通过麦胚无细胞表达体系表达可溶性的重组SjCB2和SjCE2b蛋白，分别测定无细胞表达产物、尾蚴可溶性抽提总蛋白和尾蚴分泌蛋白中SjCB2和SjCE2b的酶活性;我们还利用蛋白酶特异性抑制剂在小鼠体内分析了SjCB2，SjCE2b和Sjcalpain在日本血吸虫入侵过程中的作用。
　　结果：质谱分析结果表明，尾蚴可溶性抽提总蛋白鉴定出685种蛋白，而尾蚴分泌蛋白鉴定出59种;成功实现了SjCB2， SjCE2b， Sjcalpain催化活性位点片段和Ca2+结合位点片段，SjME，SjM17，SjM16和SjP7的原核表达，相对分子质量(Mr)分别约为65 KDa、31 KDa、43 KDa和39 KDa、50 KDa、60 KDa、51 KDa和34 KDa，均与预期大小一致，组氨酸标签亲和层析成功纯化得到8种目的重组蛋白;间接ELISA结果显示纯化蛋白对应的多克隆抗体效价均超过1∶80000;免疫定位结果显示，SjCB2，SjCE2b和Sjcalpain均主要分布在日本血吸虫尾蚴头部;酶活测定结果显示，无细胞表达产物、尾蚴总蛋白和尾蚴分泌蛋白中均显示出较高的SjCB2和SjCE2b蛋白酶活性;尾蚴侵染抑制实验中，尾蚴与SjCB2特异性抑制剂，SjCE2b特异性抑制剂，Sjcalpain特异性抑制剂和SjCE2b兔多抗孵育后感染小鼠，减虫率分别为48.0％、33.3％、17.4％和27.2％。
　　结论：SjCB2，SjCE2b和Sjcalpain在尾蚴中均有较高的丰度且主要分布于尾蚴头部，体内抑制剂实验结果表明SjCB2、SjCE2b和Sjcalpain三种蛋白酶均参与了日本血吸虫尾蚴入侵宿主皮肤的过程。
　　综上所述，本研究利用蛋白酶学、分子生物学以及免疫学等方法对日本血吸虫入侵宿主相关尾蚴蛋白酶的功能进行了深入研究，研究结果为日本血吸虫侵染分子机制的揭示提供理论基础，并为研发抗血吸虫病的疫苗和药物提供了新线索。

目录

摘要

第1章 序言

1．1 血吸虫及血吸虫病概况

1．1．1 血吸虫的分类

1．1．2 血吸虫病的流行情况

1．1．3 血吸虫的形态及生活史

1．1．4 血吸虫病的危害及症状

1．2 血吸虫侵染过程中的关键尾蚴蛋白酶研究进展

1．2．1 半胱氨酸蛋白酶的研究进展

1．2．2 丝氨酸蛋白酶的相关研究

1．2．3 钙蛋白酶的相关研究

1．3 小结

1．4 研究意义

第2章 实验材料与仪器设备

2．1 实验材料

2．1．1 日本血吸虫尾蚴

2．1．2 动物

2．1．3 载体和菌株

2．1．4 酶和Marker

2．1．5 试剂盒

2．1．6 抗生素

2．1．7 抗体

2．1．8 纯化介质和预装柱

2．1．9 酶活测定底物

2．1．10 抑制剂

2．1．11 常用溶液及培养基

2．1．12 其它

2．2 主要仪器设备

第3章 尾蚴可溶性抽提总蛋白和分泌蛋白的蛋白质组分析

3．1 实验方法

3．1．1 尾蚴分泌蛋白的收集

3．1．2 尾蚴总蛋白的收集

3．1．3 质谱分析

3．2 实验结果

3．2．1 尾蚴可溶性抽提总蛋白质谱鉴定结果

3．2．2 尾蚴分泌蛋白质谱鉴定结果

3．3 总结与讨论

第4章 日本血吸虫组织蛋白酶B2(SjCB2)的表达及功能分析

4．1 实验方法

4．1．1 SjCB2的生物信息学分析

4．1．2 SjCB2的原核表达及纯化

4．1．3 兔多克隆抗血清的制备

4．1．4 Western blot分析SjCB2兔多克隆抗体免疫原性

4．1．5 SjCB2在尾蚴组织中的免疫荧光定位

4．1．6 麦胚无细胞(Wheat germ cell-free，WGCF)蛋白表达体系表达SjCB2蛋白

4．1．7 SjCB2酶活测定

4．1．8 尾蚴侵染抑制实验

4．2 实验结果

4．2．1 生物信息学分析

4．2．2 SjCB2的克隆、表达及纯化

4．2．3 重组SjCB2蛋白在大肠杆菌中诱导表达

4．2．4 SjCB2重组蛋白的纯化

4．2．5 SjCB2兔多克隆抗体滴度

4．2．6 SjCB2蛋白免疫原性分析

4．2．7 SjCB2在尾蚴组织中的免疫荧光定位

4．2．8 SjCB2的无细胞表达

4．2．9 酶活测定

4．2．10 尾蚴侵染抑制实验

4．3 总结与讨论

第5章 日本血吸虫尾蚴弹性蛋白酶基因(SjCE2b)的表达及功能分析

5．1 实验方法

5．1．1 SjCE2b蛋白的原核表达

5．1．2 SjCE2b重组蛋白的纯化

5．1．3 ELISA检测SjCE2b兔多抗滴度

5．1．4 SjCE2b兔多抗的纯化

5．1．5 SjCE2b蛋白的免疫荧光定位

5．1．6 SjCE2b兔多抗抑制尾蚴侵染实验

5．1．7 WGCF体系表达重组SjCE2b蛋白

5．1．8 SjCE2b蛋白酶活测定

5．1．9 SjCE2b抑制剂抑制尾蚴侵染实验

5．2 实验结果

5．2．1 重组SjCE2b蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

5．2．2 SjCE2b重组蛋白的纯化

5．2．3 SjCE2b兔多克隆抗体滴度

5．2．4 SjCE2b在尾蚴组织中的免疫荧光定位

5．2．5 SjCE2b兔多抗抑制尾蚴侵染实验

5．2．6 WGCF体系表达重组SjCE2b蛋白

5．2．7 SjCE2b蛋白酶活测定

5．2．8 SjCE2b抑制剂抑制尾蚴侵染实验

5．3 总结与讨论

第6章 日本血吸虫钙蛋白基因(Sjcalpain)的原核表达及功能分析

6．1 实验方法

6．1．1 Sjcalpain的生物信息学分析

6．1．2 Sjcalpain催化位点区域和Ca2+结合位点区域编码基因的扩增

6．1．3 PCR产物双酶切及回收

6．1．4 pET-28a载体片段的制备

6．1．5 重组质粒的构建

6．1．6 重组蛋白的诱导和表达

6．1．7 重组蛋白的纯化

6．1．8 Sjcalpain催化位点和Ca2+结合位点蛋白兔多克隆抗血清的制备

6．1．9 Western blot分析Sjcalpain催化位点和Ca+结合位点蛋白兔多克隆抗体免疫原性

6．1．10 Sjcalpain在尾蚴组织中的免疫荧光定位

6．2 实验结果

6．2．1 生物信息学分析

6．2．2 Sjcalpain催化位点蛋白和Ca2+结合位点蛋白编码基因的扩增与重组质粒的鉴定

6．2．3 重组蛋白的原核表达及纯化

6．2．4 Sjcalpain催化位点和Ca2+结合位点兔多克隆抗血清的制备及滴度测定

6．2．5 Sjcalpain在尾蚴中的组织定位

6．2．6 尾蚴侵染抑制实验

6．3 总结与讨论

第7章 日本血吸虫尾蚴分泌物中其它蛋白酶的原核表达

7．1 金属内切肽酶(Metallo endopeptidase，SjME)的原核表达及多抗制备

7．1．1 实验方法

7．1．2 实验结果

7．2 M17氨基肽酶(M17 family aminopeptidase，SjM17)的原核表达及多抗制备

7．2．1 实验方法

7．2．2 实验结果

7．3 线粒体金属肽酶M16(Mitochondrial metallo peptidase M16，SjM16)的克隆表达及多克隆抗体制备

7．3．1 实验方法

7．3．2 实验结果

7．4 蛋白酶体β型7亚单位(Proteasome beta type 7 subunit，SjP7)的克隆表达及复性

7．4．1 实验方法

7．4．2 实验结果

7．5 总结与讨论

第8章 总结与展望

8．1 总结

8．2 创新点

8．3 展望

参考文献

附录

致谢

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