几种农药对中华蟾蜍的生态毒理效应及分子毒性研究

摘要

农药作为人类的生产物资，在一定时期内无法替代。随着人类健康和生态环境的恶化，农药产生的负面影响必然成为人类关注的问题之一。我国是农药生产大国，在创造经济价值的同时，农药中毒事件层出不穷，农药残留引起的贸易争端悬而未决，生物种群的日渐衰退甚至濒临灭绝，尤其是两栖动物的灭绝速度非常之快，令人吃惊。随着这些问题的日益突出，国内外专家对农药的健康风险评价和生态风险评价十分关注，并提到政府的议事日程。
　　 生态毒理学研究是生态风险评价重要的科学基础，其研究的基本方法是通过对代表性的生物个体或群体进行研究。两栖动物在环境安全性评价中具有重要地位。从整个环境生态系统看，两栖类处于食物链中物质和能量传递的重要地位；从环境生态监测角度看，两栖类对环境污染物非常敏感；从模式生物角度来看，国外选用了非洲爪蟾作为动物模型进行各种环境化学物质筛选和评价。随着对人类回归大自然的重要性以及对人类与非人类生物之间相互依存关系重要性的深入了解，在环境毒理学的模式生物不可替代的情况下，也要进行野外生物物种生态毒性效应的研究。
　　 因此，本论文选用农田目前大量使用的几种杀虫剂(毒死蜱、二嗪磷和氟虫腈)和除草剂(乙草胺、丁草胺、百草枯、二氯喹啉酸和氯嘧磺隆)，以国内农田和湿地环境生态中普遍存在的两栖动物--中华蟾蜍这种野生动物为研究对象，通过对这些农药的一般毒性作用、致突变作用、生殖发育毒性作用研究，初步评价几种农药对中华蟾蜍的毒性效应。
　　 (1)一般毒性效应评价：通过急性毒性实验研究了几种农药对中华蟾蜍的毒性强度，并且明确了毒物浓度与蟾蜍蝌蚪死亡率之间的剂量效应关系。结果表明：对中华蟾蜍蝌蚪的毒性分别为毒死蜱和丁草胺属于高毒农药；二嗪磷和乙草胺属于中等毒性；二氯喹啉酸、百草枯和氯嘧磺隆属于低毒。从以上几种农药中选毒死蜱、乙草胺进行亚慢性毒性实验，结果显示的0.1 mg/l毒死蜱和乙草胺处理组的中华蟾蜍蝌蚪体长的日增长率与对照有显著性差异(P<0.01)。结果表明这两种农药对蝌蚪有慢性毒性风险。
　　 (2)致突变效应研究：运用微核实验检测几种农药对蝌蚪血细胞染色体损伤，结果显示毒死蜱、二嗪磷、乙草胺、丁草胺和百草枯高浓度处理组血细胞微核率均显著高于对照组(P<0.01)，氟虫腈、氯嘧磺隆和二氯喹啉酸处理组血细胞微核率与对照差异不显著，没有统计学意义；计算农药处理组的核异常率，并进行线性回归，得出毒死蜱、二嗪磷、乙草胺、丁草胺和百草枯的处理浓度与细胞核异常率呈线性相关性，说明剂量-反应关系。通过彗星实验检测几种农药对蝌蚪血细胞DNA的损伤作用，结果显示毒死蜱、二嗪磷、氟虫腈、乙草胺、丁草胺和百草枯的处理浓度与彗星Oliver尾矩呈线性相关，并且与对照差异显著(P<0.01)；氯嘧磺隆和二氯喹啉酸均在较低浓度处理时，与对照差异显著。结果表明毒死蜱、二嗪磷、丁草胺、乙草胺和百草枯对中华蟾蜍蝌蚪具有遗传毒性，氟虫腈、二氯喹啉酸和氯嘧磺隆不引起染色体损伤，但对DNA损伤有更复杂的作用机理。
　　 (3)生殖发育毒性效应研究：通过精子畸形实验研究了农药毒死蜱、二嗪磷、丁草胺、百草枯和乙草胺对雄性中华蟾蜍生殖毒性作用。结果显示，毒死蜱、二嗪磷、丁草胺和百草枯各处理组均引起精子畸形，其中毒死蜱、二嗪磷和百草枯处理浓度与精子畸形率有剂量-相关性，说明这精子畸形实验结果为阳性。通过胚胎致畸实验研究几种农药的胚胎发育毒性，结果显示：农药毒死蜱、氟虫腈、二嗪磷、丁草胺、二氯喹啉酸、氯嘧磺隆和乙草胺TI值分别为：0.64，1.30，1.33，0.39，0.45，0.33和0.55，均小于1.5。因此，对中华蟾蜍的胚胎发育可能不具有致畸影响。
　　 在上述研究的基础上，论文继续深入。以成年蟾蜍(雌雄分组)为研究对象，通过腹腔注射法，低剂量连续曝露10 d，从细胞和分子水平上开展了农药对中华蟾蜍的分子致突变效应、致癌作用和细胞凋亡研究。主要从以下几个方面开展：
　　 (1)DNA链断裂的检测：通过碱性单细胞凝胶电泳实验检测几种低剂量农药影响蟾蜍血细胞和肝细胞DNA链断裂情况。结果显示，0.05 mg/kg毒死蜱、二嗪磷和百草枯连续处理10 d后，彗星实验数据得出雄性蟾蜍血细胞和肝细胞彗星Oliver尾矩与对照组差异显著(P<0.01)，并且肝细胞彗星Oliver尾矩显著大于血细胞的；雌性蟾蜍血细胞和肝细胞彗星Oliver尾矩(除百草枯外)，均与对照的彗星Oliver尾矩没有显著差异。0.01 mg/kg丁草胺和乙草胺处理组的雄性和雌性蟾蜍血细胞彗星Oliver尾矩均显著大于对照组(P<0.01)。结果表明，低剂量的毒死蜱、二嗪磷、丁草胺、乙草胺和百草枯连续处理中华蟾蜍，对血细胞和肝细胞DNA链有断裂作用。
　　 (2)DNA-蛋白质交联的检测：DNA-蛋白质交联可以作为生物体潜在突变的分子标志物，并在一定程度上阐明致癌作用机理。实验通过加入蛋白酶K后过夜孵育，改良彗星实验实现检测DPC，用加入蛋白酶K前后的处理组彗星尾矩的比值反映DNA-蛋白质交联作用强度。统计分析TE处理组和PK处理组的彗星尾矩，求出比值。结果显示0.1 mg/kg处理组PK/TE值显著高于对照组(P<0.01)，大小依次为百草枯、毒死蜱、丁草胺和乙草胺。结果表明这几种农药对蟾蜍(雄性)血细胞产生DNA-蛋白质交联作用。
　　 (3)DNA碱基突变的检测：RAPD-PCR对于检测DNA碱基序列突变作用有较高的优越性，通过实验优化RAPD-PCR反应条件，检测中华蟾蜍肝细胞DNA多态性，筛选出两个引物(S1，S8)，并对反应扩增产物分析统计，引物S1扩增毒死蜱、二嗪磷和百草枯处理后的蟾蜍肝细胞DNA的产物与对照有差异，出现明显的谱带增加或消失现象；引物S8扩增丁草胺、乙草胺和阳性对照，出现明显的谱带增加或消失现象。说明以上农药可能对DNA碱基序列突变有一定的贡献。
　　 (4)DNA甲基化水平的检测：DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，致癌物常常对DNA甲基化水平产生影响。实验通过高效液相色谱法检测几种农药对蟾蜍肝细胞和生殖细胞DNA甲基化水平的影响。结果显示0.1 mg/kg的毒死蜱和百草枯处理组的肝细胞(雄)和精细胞DNA水平与对照相比显著差异(P<0.01)；二嗪磷处理组的精细胞DNA甲基化水平与对照差异显著(P<0.01)。
　　 (5)细胞凋亡的研究：细胞凋亡又称细胞程序性死亡，指有核细胞在一定条件下，通过启动其自身内部机制，主要通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自然死亡过程。DNA损伤是诱发细胞凋亡的一个诱因。通过Giemsa-Wright染色法和彗星实验检测较高浓度处理的中华蟾蜍蝌蚪血细胞凋亡指数，结果显示毒死蜱、百草枯、丁草胺和乙草胺的浓度与血细胞凋亡指数呈一定的剂量关系效应，并且与对照差异显著(P<0.01)，二嗪磷处理组与对照差异不显著。通过DNA-Lander实验法检测低剂量农药对中华蟾蜍肝细胞的凋亡影响，琼脂糖凝胶电泳图片显示，0.1 mg/kg毒死蜱、百草枯、丁草胺和乙草胺处理组的肝细胞均在180-200bp产生小的DNA片段，结果表明这几种农药低剂量连续曝露诱导肝细胞凋亡。
　　 综上所述，通过研究几种杀虫剂和除草剂的生态毒理效应研究及其评价，得出毒死蜱、二嗪磷、丁草胺和百草枯具有生殖毒性和致突变效应，并诱导细胞凋亡；乙草胺具有致突变效应，并诱导细胞凋亡。研究从一定程度上突破传统的思路，并通过细胞和分子水平研究了致突变效应类型和机理。论文认为在未来的野外生态毒理检测中，可以将RAPD-PCR作为首要的生物检测指标，进行初步筛选。然后通过彗星试验和微核试验组合作为鉴定污染物致突变效应的手段，辅以DNA甲基化和DNA蛋白质交联试验进一步检测致癌作用和DNA损伤类型。本论文为中华蟾蜍的野外生态毒理研究奠定坚实的基础，并为生态风险评价提供科学数据。

目录

文摘

英文文摘

主要缩略语表

第一章 绪 论

第一节 农药对两栖动物生态毒理学研究现状

1.1 农药对农田两栖类种群衰退的影响

1.2 农药对两栖动物的生态毒理学研究进展

1.3 两栖动物生态毒理研究目前存在的问题

第二节 两栖动物中华蟾蜍的生态学研究现状

2.1 中华蟾蜍生物学特性

2.2 生态和经济价值

第三节 研究目的、意义和内容

3.1 研究目的和意义

3.2 研究内容

第二章 几种农药对中华蟾蜍的一般毒性评价

第一节 几种农药对中华蟾蜍的急性毒性评价

1.1 材料和方法

1.2 数据统计

1.3 结果与讨论

第二节 几种农药对中华蟾蜍的亚慢性毒性评价

2.1 材料和方法

2.2 统计分析

2.3 结果与讨论

小结

第三章 几种农药对中华蟾蜍蝌蚪的致突变效应的研究

第一节 农药对中华蟾蜍蝌蚪血细胞微核及核异常的影响

1.1 材料和方法

1.2 统计分析

1.3 结果与讨论

第二节 几种农药对两种蝌蚪血红细胞DNA损伤研究

2.1 材料和方法

2.2 数据分析与统计

2.3 结果与讨论

小结

第四章 几种农药对中华蟾蜍生殖发育毒性的研究

第一节 几种农药对中华蟾蜍生殖毒性的影响

1.1 材料与方法

1.2 统计分析

1.3 结果和讨论

第二节 几种农药对中华蟾蜍胚胎发育毒性影响

2.1 材料和方法

2.2 统计与分析

2.3 结果和讨论

小结

第五章 几种农药对中华蟾蜍的分子致突变效应研究

第一节 几种农药对中华蟾蜍DNA链断裂的测定

1.1 材料和方法

1.2 统计分析

1.3 结果与讨论

第二节 农药对中华蟾蜍血细胞的DNA-蛋白质交联测定

2.1 材料和方法

2.2 数据统计分析

2.3 结果与讨论

第三节 几种农药对中华蟾蜍DNA点突变测定

3.1 材料和方法

3.2 结果分析与讨论

第四节 几种农药对中华蟾蜍肝细胞DNA甲基化水平的测定

4.1 材料与方法

4.2 数据处理与分析

4.3 结果与讨论

小结

第六章 几种农药诱导中华蟾蜍细胞凋亡的研究

第一节 几种农药诱导中华蟾蜍蝌蚪血细胞凋亡作用研究

1.1 材料和方法

1.2 统计与分析

1.3 结果与讨论

第二节 几种农药诱导中华蟾蜍成蛙细胞凋亡作用

2.1 材料和方法

2.2 结果与讨论

小结

第七章 总结与讨论

7.1 结论

7.2 结论归纳

7.3 讨论

7.4 主要创新点

7.5 论文不足之处和展望

参考文献

在读硕博期间发表论文

致谢