异源宿主中蛋白质内含子剪接活性的定向进化

摘要

蛋白质内含子(intein)是存在于宿主蛋白质前体中的一段多肽序列。它能够催化自身从蛋白质前体中剪切下来，同时将两侧多肽序列以肽键相连。这种翻译后的加工过程称为蛋白质剪接(protein splicing)。蛋白质内含子自主催化的剪接反应为蛋白质的合成和加工提供了新的途径，因而在蛋白质工程及其它领域中具有广泛的应用前景。但是目前所发现的天然蛋白质内含子数量有限，而且大部分在非天然宿主中的剪接活性显著降低，因此限制了蛋白质内含子的开发和利用；同时由于对蛋白质内含子结构与剪接功能之间的关系仍不十分了解，因此很难通过理性设计和改造来提高蛋白质内含子的剪接活性。
　　 本研究以具有极低剪接活性的蛋白质内含子为实验材料，利用定向进化策略，最终达到提高其在异源宿主中剪接活性的目的。首先对来自Trichodesmium erythraeum的DnaB-1、RIR1-3和DnaE-3蛋白质内含子(TerDnaB-1、Ter DnaE-3、Ter RIR1-3)以及来自Cryptococcus neoformans AD血清型的PRP8蛋白质内含子(Cne-AD PRP8)进行改造，分别获得各自的人工型微小蛋白质内含子和断裂蛋白质内含子，然后利用麦芽糖结合蛋白(meltosebinding protein，MBP)和硫氧还蛋白(thioredoxin)组成的检测系统对各蛋白质内含子在大肠杆菌中的剪接活性进行检测。结果表明Ter DnaE-3和Cne-AD PRP8人工型蛋白质内含子在大肠杆菌中具有较高的剪接活性，Ter DnaB-1和TerRIR1-3则几乎没有剪接活性。结合本实验室对其他蛋白质内含子的研究结果，选择Ter DnaE-1和Ter，DnaE-2人工型微小蛋白质内含子(简称为TE1-m和TE2-m)进行蛋白质剪接活性的定向进化研究。定向进化策略采用易错PCR(error prone PCR)构建相应的突变库，然后利用依赖卡那霉素抗性所建立的蛋白质剪接筛选系统进行快速有效的筛选，即将TE1-m和TE2-m的编码序列插入卡那霉素抗性基因中，造成卡那霉素抗性基因编码的磷酸转移酶(phosphotransferase)失活。蛋白质内含子经过进化后发生剪接，磷酸转移酶恢复原始的结构和活性，从而能够在含有一定浓度卡那霉素的平板上生长。本研究共进行三轮筛选：第一轮在卡那霉素浓度为5μg/ml的平板上筛选，共获得20个阳性突变体；第二轮在卡那霉素浓度为10μg/ml的平板上筛选，共获得11个阳性突变体；第三轮在卡那霉素浓度为20μg/ml的平板上筛选，没有获得阳性突变体。所获得的突变体均利用Western印迹对其蛋白质剪接活性进行鉴定。实验结果表明经过两轮易错PCR，有效突变积累后，获得一个剪接活性明显提高的突变体pK⊿TE2-⊿G。该突变体中有三处突变，其中两处分别是TE2-m的第52位氨基酸(由Ile变为Phe，I52F)和第100位氨基酸(由Pro变为Ser，P100S)；第三处是载体上-1位氨基酸，即与TE2-m的N端相连的第一个氨基酸，由Ala变为Gly(A-1G)。进一步的研究表明这三处突变共同决定了蛋白质剪接的发生。
　　 该研究表明定向进化策略可以提高蛋白质内含子的剪接活性，从而为蛋白质内含子的开发和应用提供更加丰富的材料来源。同时通过定向进化策略获得的有效突变体可以为进一步探索蛋白质内含子结构与剪接功能之间的关系带来新的启示，为推测蛋白质内含子的起源和进化提供更多的线索。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 蛋白质内含子的结构和分类

1.3 蛋白质内含子的剪接机制

1.4 蛋白质内含子的应用

1.5 定向进化的策略方法

1.6 蛋白质定向进化的意义及应用

1.7 课题研究的目的、内容和意义

第二章 实验材料、基本技术和设计方案

2.1 实验材料和仪器

2.2 实验基本技术

2.3 实验设计方案

第三章 实验过程

3.1 四个天然蛋白质内含子的改造

3.2 Western印迹检测人工型蛋白质内含子的剪接活性

3.3 蛋白质剪接活性的定向进化

第四章 实验结果与分析

4.1 四个天然蛋白质内含子的改造

4.2 Western印迹鉴定人工型蛋白质内含子的剪接活性

4.3 蛋白质剪接活性的定向进化

第五章 结论

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

硕士期间发表论文和参加科研情况说明

致谢