德兴铜矿污染土壤重金属形态分布特征及微生物分子生态多样性研究

摘要

土壤是重金属的一个重要蓄积库，其所含重金属的毒性不仅与其总量有关，更大程度上由其形态分布所决定，其中重金属的生物可利用性含量部分可以通过食物链被植物、动物数十倍地富集，从而对人体健康造成危害。土壤中的微生物是土壤有机组分和生态系统中最活跃的部分，在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用，被认为是最敏感的土壤质量生物学指标。重金属对土壤中微生物的生态效应一方面表现在生物量、代谢活性、种类数量和多样性降低;一方面又因为重金属的选择和生物的适应性反应，使得污染环境中生长有大量耐受重金属污染的类群。可以说，微生物群落组成和多样性动态变化，能反映土壤中生物类群的多变性和土壤质量在微生物数量和功能上的差异性。为了更好地了解土壤健康状况，了解重金属污染对微生物群落结构的影响，非常有必要深入对污染土壤的微生物多样性、群落结构组成以及与重金属相互作用关系等进行研究。本文以德兴铜矿4＃尾砂库为研究对象，采集尾砂样品以及周围农田和菜地土壤样品共16件进行相关分析研究。
　　 (1)对样品中重金属以及其他元素总量进行测定，采用Tessier顺序提取方法对重金属Cu，Cd和Zn进行形态分析，然后分别根据总量采用国标方法(GB15618-1995)以及根据重金属生物可利用性含量采用风险评价编码(RiskAssessment Code，RAC)两种方法评价土壤重金属污染情况。结果发现该地区样品受到不同程度的Cu、Cd、Zn、Ni、Pb、和Cr的污染，说明该尾矿库重金属污染对周边农业土壤有影响。形态分析结果表明，Cu主要以有机结合态和残渣态存在;Cd主要以离子交换态存在;Zn在大部分样品中主要以残渣态存在。采用两种方法对样品中重金属Cu、 Cd和Zn环境风险进行评价，结果表明除了重金属Cd评价的结果比较一致外，对于重金属Cu和Zn，大部分样品中两种评价结果存在明显差异。从研究结果来看，该地区重金属Cd污染已经达到了污染非常严重的程度，需要人们给予更多的关注。同时，从结果来看我们认为一个适当的、充分的、合理的环境风险评价标准应该同时包含重金属总量和生物可利用性含量两部分标准。本文对德兴铜矿4＃尾矿库及周边农业土壤样品进行重金属形态分析，并结合风险评价编码(RAC)方法首次根据重金属可利用性含量对该地区长期受重金属土壤样品进行重金属污染风险评价，具有重要参考价值。
　　 (2)样品中微生物分子生态多样性变化情况研究。首先对16个样品中可培养异养细菌进行平板计数，结果发现在尾砂样品T4和T7中可培养异养细菌数量最少，约0.5×107 cfu/g土壤干重;在菜地土壤样品中为1.40-2.75×107 cfu/g土壤干重，在农田土壤样品中为0.60-3.60×107 cfu/g土壤干重。
　　 对不同土壤样品16S rDNA V3区片断扩增产物采用变性梯度凝聚电泳(DGGE)进行分离，获得DNA指纹图谱，采用Quantity One软件进行UPGMA聚类分析等，发现尾砂样品T4和T7相似性比较高，达56.4％;菜地土壤样品中V11、V13、V15、V18和V20基本聚类在一起，而V8与其它样品都分离开来，说明该样品中微生物多样性与其他样品相比差异比较大;农田土壤样品中G10、G12、G14和G16聚类在一起，而样品G17、G19和G21聚类在一起。
　　 对样品进行多样性指数（Shannon-Weaver index H）计算，结果发现多样性最大出现在距离尾矿中等距离的样品中如菜地土壤样品V13、V15，农田土壤样品G12和G14等，在这些样品中重金属铜和锌的含量不高，均不超过国家土壤质量Ⅱ级标准，但也不是最低;在重金属铜和锌含量都是最高的菜地土壤样品V8、农田土壤样品G10中，以及在重金属铜和锌含量几乎都是最低，远离尾矿10 km之外的菜地土壤样品V20和农田土壤样品G19中，微生物的多样性指数相近，且均低于最大值。说明重金属浓度对微生物多样性的影响可能并不是简单的线性关系，在一定的浓度范围内有可能促进微生物多样性的发展。
　　 (3)样品中微生物群落结构组成研究。主要是采用以PCR为基础的限制性片段长度多态性分析(RFLP)方法，结合分子克隆构建基因文库，16S rDNA测序等，对样品中微生物群落结构组成进行分析。共获得236 OTUs(OperationalTaxonomic Units)，测序后各个样品中菌种数分别为T4（9种），V8(56种)，V20(40种)，G10(56种)和G19(46种)。
　　 根据测序结果发现，在五个样品中优势菌种主要有:unculturedPseudoxanthomonas sp. clone GI5-005-C10,Burkholderia sp.383, unculturedAcinetobacter sp. clone TCCC11180等十多种。进行系统发育树分析，发现在五个样品中共207种细菌被划分为15大类，即Acidobacteria纲，Actinobacteria纲，Bacteroidetes纲等细菌。在尾砂T4样品中86％的细菌克隆子数归属于γ-proteobacteria类群，是该样品中绝对优势菌群;在菜地土壤样品V8中，菌群分布为:γ-proteobacteria,α-proteobacteria,δ-proteobacteria,Planctomycetes,Acidobacteria和Bacteroidetes，分别占细菌总克隆子数的14.5％，12％，8％，14.5％，10％和9.7％，为优势菌群;在菜地土壤样品V20中，优势菌群依次为:γ-proteobacteria占25％,β-proteobacteria占16％,Cyanobacteria占12％,α-proteobacteria和Acidobacteria各占10％;在G10样品中，占最优势主导地位的类群是β-proteobacteria，包含22.5％的克隆子数，紧随其后的优势类群分别是γ-proteobacteria，α-proteobacteria, Chloroflexi和Firmicutes，各占百分比10％;在样品G19中，优势菌群依次是Acidobacteria,β-proteobacteria,α-proteobacteria，Chloroflexi和Planctomycetes，分别占G19样品中155个有效克隆子百分比为22％，17％，14％，13％和11％。总的来看，在五个样品中细菌群落结构组成差异是比较明显的。T4尾砂样品中细菌多样性最少，群落结构比较简单，优势菌群单一，优势明显;在菜地和农田样品中，细菌多样性明显增加，群落数增多，结构复杂，优势菌群多元化，优势不明显。与Janssen等人提出的典型健康土壤样品中微生物多样性及平均群落结构组成进行比较，发现本研究中的土壤样品在长期的重金属污染压力条件之下，其中微生物群落结构组成与健康土壤相比已经发生了明显改变，微生物的功能也可能发生了改变，使得这些土壤可能处于不健康状态。
　　 另外，采用PCA方法对重金属Cu，Cd和Zn及各形态与微生物群落之间的相互关系在所研究样品中首次进行了分析讨论。发现不同重金属，不同重金属形态对微生物群落分布都有不同影响。着重考虑重金属生物可利用性含量（即离子交换态和碳酸盐结合态重金属含量）与微生物群落之间的相互关系，发现离子交换态重金属铜和锌与细菌类群Act（Actinobacteria）、Bet（β-proteobacteria）、Chl（Chlorobi Chlo（ChloroflexiFir（Firmicutes）之间相关性较大;碳酸盐结合态铜和锌与细菌类群Bac(Bacteroidetes)和Ver（Verrucomicrobia）紧密相关;离子交换态和碳酸盐结合态重金属镉与细菌类群Gam(γ-proteobacteria)相关性尤为显著。我们认为或可根据微生物群落与重金属生物可利用性含量之间的相关性，用微生物群落结构的变化来指示重金属生物可利用性含量的变化，比如用Gam（γ-proteobacteria）类群数量变化来指示重金属镉的生物可利用性含量变化等。
　　 (4)重金属高抗性菌株分离鉴定及基本性质研究。采用平板分离的办法，经重金属梯度浓度诱导培养，从尾矿样品中分离筛选到三株重金属高抗性菌株:菌株DX-T3-01在镉浓度10 mM/L的固体平板和18 mM/L液体培养基中生长良好，在镉浓度16 mM/L的固体平板上能生长;DX-T3-02在铜浓度3mM/L的固体平板和6 mM/L液体培养基中生长良好，在铜浓度5mM/L的固体平板上能生长;菌株DX-T3-03在锌浓度为35 mM/L固体平板和30 mM/L液体培养基中生长良好，在锌浓度50 mM/L的固体平板上能生长。
　　 三株菌进行生理生化特性研究以及16S rDNA的同源性分析比对，发现菌株DX-T3-01与Ralstonia pickettii的菌株(GenBank登录号为CP001069)同源性为99％，菌株DX-T3-02与Methylobacterium sp.的菌株(GenBank登录号为AM910531)同源性为99％，菌株DX-T3-03与Sphingomonas sp.的菌株(GenBank登录号为AF131295)同源性为99％。分别构建系统发育树，发现其基因进化距离与同属菌种很近，与不同属的菌种相距较远，将三株菌分别命名为:Ralstonia pickettii strainDX-T3-01,Methylobacterium sp. strain DX-T3-02和Sphingomonas sp. strainDX-T3-03。本文分离到的这三株菌与已报道的同种属其他菌株相比，在重金属抗性方面具有非常显著优势。可望成为待开发的重金属生物修复优良菌剂。
　　 初步应用DGGE方法来检测特殊菌种在环境样品中的分布情况，发现三株菌在不同样品中的分布和丰度存在较大差异。基本上Ralstonia pickettii strainDX-T3-01在尾砂样品和距离尾矿库距离较近的几个样品中广泛存在，且数量较多，可能为各样品中优势菌种之一。Methylobacterium sp. strain DX-T3-02只在尾砂样品T4和菜地土壤样品V8中存在且特征条带亮度较大，在其他样品中极微弱存在或不存在，说明该菌种的分布受样品性质影响较大，特异性比较明显。而Sphingomonas sp. strain DX-T3-03在尾砂样、各菜地土壤样品和农田土壤样品中都有特征条带存在，亮度不大，说明该菌种分布广泛，特异性不明显，菌数量少，在各样品中一般为非优势菌株。该方法有可能利用来进行重金属污染监测，寻找重金属污染微生物标记物，开发重金属污染快速检测技术等。

目录

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摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 重金属污染来源及污染现状

1．3 土壤环境中重金属形态分析方法

1．4 重金属的生物可利用性及其评价方法

1．5 生物可利用性在生态风险评价中的应用

1．6 重金属污染对土壤微生物生理生态多样性的影响

1．7 基于分子水平的土壤微生物群落组成研究方法

1．8 重金属抗性菌株

1．9 课题研究意义、研究内容及技术路线

第二章 实验材料和研究方法

2．1 实验材料

2．2 研究方法

第三章 土壤样品中重金属及其形态分布

3．1 引言

3．2 土壤基本理化性质

3．3 土壤重金属及其他元素总量

3．4 土壤样品主成分分析

3．5 重金属铜、镉和锌形态分布

3．6 重金属污染环境风险评价

3．7 本章小结

第四章 变性梯度凝胶电泳方法研究土壤样品中微生物多样性

4．1 引言

4．2 可培养异养细菌计数

4．3 土壤样品基因组DNA的16S rDNA-PCR扩增

4．4 16S rDNA V3可变区PCR扩增

4．5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

4．6 DGGE电泳DNA指纹图谱分析

4．7 多样性指数(Shannon-Weaver index H)分析

4．8 本章小结

第五章 限制性片段长度多态性分析微生物群落结构和组成

5．1 引言

5．2 样品基本理化性质

5．3 重金属Cu、Cd和Zn的形态分析

5．4 土壤样品中细菌16S rDNA扩增及其纯化

5．5 细菌16S rDNA连接、转化及其酶切

5．6 细菌16S rDNA片断RFLP饱和度分析和测序

5．7 系统发育树分析

5．8 群落结构与重金属形态之问相关性分析

5．9 本章小结

第六章 重金属铜、镉、锌高抗性特殊菌种分离鉴定及性质研究

6．1 引言

6．2 固体平板法直接分离重金属高抗性菌株

6．3 细菌形态观察

6．4 固体平板上细菌耐受其他重金属的能力

6．5 液体培养基中重金属对细菌生长的影响

6．6 菌株生理生化性质

6．7 三菌株16S rDNA系统发育树分析

6．8 DGGE方法检测重金属高抗性菌种在重金属污染土壤样品中的分布

6．9 讨论

6．10 本章小结

第七章 结论与展望

参考文献

博士期间发表论文、申请专利及获奖情况

致谢