木醋杆菌炼制纤维素废料制备细菌纳米纤维素的研究

摘要

细菌纤维素(bacterial cellulose，简称BC)是一种由微生物产生的具有纳米结构的纤维素，因此，也称为细菌纳米纤维素。与植物纤维素相比它具有许多优良的特性，譬如:高持水性、高聚合度、高结晶度、高纯度、良好的生物相容性和高机械强度，因此在生物医学材料、食品、高级音响振动膜、燃料电池、造纸和纺织等领域具有广阔的应用前景。由于细菌纤维素生产成本偏高，尤其是培养基成本偏高，限制了其规模化工业生产和商业应用。纤维素废料是地球上最丰富的可再生聚糖类资源，可作为生物炼制的碳源。由于其来源广、价格低，因此最有希望用于细菌纤维素的规模化低成本发酵生产。本文从细菌纤维素规模化工业生产和纤维素废料资源化利用的多角度出发，利用不同来源的纤维素废料开发细菌纤维素的生物炼制技术。
　　由于原料的结构和化学组成不同，在生物炼制过程中所面临的问题也不尽相同。因此，本文针对高效生物利用木质纤维素资源的共性关键技术，分别以纤维素行业（纺织和造纸）中产生的三种不同纤维素废料为原料模型，研究探讨这三种原料制备细菌纤维素的可行性，重点研究制备细菌纤维素过程中所遇到的关键技术问题。主要包括原料水解前预处理、水解液脱毒、降低纤维素酶水解成本、发酵废液资源化利用和废液减排等核心问题。通过对以上问题的研究，开发针对不同类型纤维素废料制备细菌纤维素的共性关键技术，为今后的细菌纤维素规模化工业生产提供必需的技术路线，并倡导资源节约型理念。本文的主要研究内容和结果如下:
　　1、以云杉木屑为原料，经SO2预处理、酶水解获得可发酵糖以制备细菌纤维素。重点比较了多种脱毒方法对水解液中抑制物的去除效果，并研究了水解液脱毒前后对木醋杆菌生长和细菌纤维素产量的影响。结果显示活性炭吸附脱毒对抑制物去除效果最好，在四大类主要抑制物的去除中效率最高，分别去除了94％的醛类、88％的酚类、39％的甲酸和28％的乙酸，因此BC产量也最高。木醋杆菌主要利用葡萄糖，少量利用木糖和甘露糖，几乎不利用阿拉伯糖和半乳糖。乙酸比甲酸更易被细菌代谢利用，糠醛和5-羟甲基糠醛除了挥发外还应该可以被细菌消耗或转化为其它化合物。通过酚氧化酶的专一性去除酚类抑制物的实验结果表明，水解液中的酚类相对于弱酸和呋喃醛类抑制物有更强的抑菌性，是今后木质纤维素水解液制备细菌纤维素工艺中必须重点除去的抑制物。
　　2、以硫酸盐和亚硫酸盐纸浆废料为原料，经直接酶水解获得可发酵糖以制备细菌纤维素。重点探讨以酶水解液为碳源制备细菌纤维素及其发酵废液资源化利用制备木质纤维素水解酶的可行性。结果显示，两种纸浆废料经水解后都能很好地作为碳源生产细菌纤维素。硫酸盐和亚硫酸盐纸浆酶解液制备的细菌纤维素产量分别可达11和10g/L，但是里氏木霉利用两种发酵废液的产酶情况差异巨大。硫酸盐纸浆发酵废液为速效碳源，补充硫酸盐纸浆为诱导物时，纤维素酶活力可达5.2U/mL，与葡萄糖为速效碳源获得的活力(5.1U/mL)相当，然而木聚糖酶活力高达74.7U/mL，比葡萄糖对照组的22.6U/mL高了3倍多。以亚硫酸盐纸浆发酵废液为速效碳源，亚硫酸盐纸浆为诱导物时，纤维素酶和木聚糖酶的活力都很低，但是分别以发酵废液和亚硫酸盐纸浆与其它碳源结合时都能获得接近于葡萄糖对照组的活力。综合分析后发现，可能是亚硫酸盐纸浆废料发酵液结合亚硫酸盐纸浆废料会产生强抑制，不利于产酶。为寻找其中可能的抑制物，探讨在培养基中添加小于100mM的Na2SO4和小于10mM的Na2SO3对里氏木霉产酶的影响。结果发现100mM浓度以内的硫酸钠对提升纤维素酶和木聚糖酶活力都有一定作用，尤其促木聚糖酶活力明显。5mM以内的亚硫酸盐也具有一定的促产酶效果，但是当浓度达到10mM时会强烈抑制产酶。生物炼制企业的发酵废液资源化利用产纤维素水解酶，不仅可以减少废液排放，而且可以充分利用原料资源，获得的水解酶用于补充木质纤维素原料水解用酶以降低酶解成本。
　　3、以废弃棉织物为原料，通过新型绿色溶剂——离子液体[AMIM]Cl预处理以提高酶水解效率和得糖率，成功制备细菌纤维素。获最佳酶解效果所需的处理工艺为:1g棉布在110℃下溶于10g离子液体。再生棉纤维素中残余[AMIM]Cl浓度高于20mg/mL时将抑制纤维素酶的活性;浓度高于0.5mg/mL时会降低BC产量。研究发现，当活性染料浓度超过5g/L时也会抑制纤维素酶活力，降低酶水解效率;当浓度大于1g/L时，则会抑制BC产量。预处理后棉织物的酶解得糖率可达95％以上，是未处理的3-6倍。棉织物酶解液可以成功制备BC，产量比葡萄糖对照组高出约2倍。离子液体预处理显著提高酶解效率和得糖率，为木质纤维素资源的高效利用提供了新途径。
　　4、为了进一步研究发酵废液产酶的机理，本文研究了不同微生物源的发酵废液对里氏木霉生产木质纤维素水解酶的影响。结果表明利用木醋杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的发酵废液都可以作为里氏木霉的培养基组分生产纤维素酶和木聚糖酶。纤维素酶活力与葡萄糖对照组的相当，而木聚糖酶活力比对照组的高3-15倍。促进产酶的原因可能包括:发酵废液中剩余的原培养基成分（譬如:氮源和无机盐等），以及微生物的代谢物（譬如:寡糖等）。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 细菌纤维素概况

1．1．1 细菌纤维素的生产菌种和培养方式

1．1．2 细菌纤维素的生物合成

1．1．3 细菌纤维素的结构、理化特性和应用

1．2 细菌纤维素发酵原料的研究进展

1．2．1 合成或半合成培养基生产细菌纤维素

1．2．2 天然培养基生产细菌纤维素

1．3 纤维素废料制备细菌纤维素的生产技术

1．3．1 纤维素废料的预处理技术

1．3．2 纤维素废料水解液的脱毒处理

1．3．3 细菌纤维素发酵工艺的研究

1．4 纤维素废料制备细菌纤维素存在的问题

1．5 本论文主要研究内容

参考文献

第二章 以云杉木屑为原料制备细菌纤维素的研究

2．1 前言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验流程

2．2．3 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 脱毒方法对云杉水解液各成分的影响

2．3．2 云杉水解液制备细菌纤维素

2．3．3 抑制物去除效果对BC产量的影响

2．3．4 酚类抑制物对BC合成的影响

2．4 小结

参考文献

第三章 以纸浆废料为原料制备细菌纤维素的研究

3．1 前言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验流程

3．2．3 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 纸浆废料酶解液制备细菌纤维素

3．3．2 稀释4倍酶解液制备细菌纤维素的历程

3．3．3 细菌纤维素膜的表征

3．3．4 发酵废液制备木质纤维素水解酶

3．3．5 亚硫酸盐纸浆废料抑制产酶原因分析

3．3．6 Na2SO4和Na2SO3对产酶的影响

3．4 小结

参考文献

第四章 以废弃棉织物为原料制备细菌纤维素的研究

4．1 前言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验流程

4．2．3 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 白色废弃棉织物在离子液体中的溶解

4．3．2 棉织物酶解液制备细菌纤维素

4．3．3 彩色废弃棉织物在离子液体中溶解性能研究

4．3．4 彩色棉织物酶解液制备细菌纤维素

4．3．5 白色废弃棉织物与彩色废弃棉织物处理效果比较

4．4 小结

参考文献

第五章 不同发酵废液制备木质纤维素水解酶及产酶机理探讨

5．1 前言

5．2 实验材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验流程

5．2．3 实验方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 木醋杆菌发酵废液制备木质纤维素水解酶

5．3．2 大肠杆菌发酵废液制备木质纤维素水解酶

5．3．3 金黄色葡萄球菌发酵废液制备木质纤维素水解酶

5．3．4 诱导物对产酶的影响

5．3．5 发酵废液促进里氏木霉高产木聚糖酶机理探讨

5．4 小结

参考文献

第六章 结论与展望

6．1 结论与创新点

6．1．1 结论

6．1．2 创新点

6．2 展望

攻读博士学位期间的研究成果

致谢