绿色工艺制备聚乙烯亚胺衍生物在细胞支架和介导基因转染中的研究

摘要

聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)作为典型的阳离子聚合物之一，已经广泛应用于组织工程支架以及作为基因转染的载体。由于PEI本身血液相容性较差，细胞毒性大等缺点严重制约了其进一步应用。利用化学方法对PEI分子改性是一种有效降低其细胞毒性和改善血液相容性的方法。生物材料通过静电纺丝技术制备的具有极大比表面积的纳米纤维可以很好地模拟天然细胞外基质，为细胞的粘附、增殖及为生理功能提供良好的微环境。
　　本论文结合两性离子化合物良好的生物相容性优势，设计合成两性离子化合物PEI衍生物。利用高压静电纺丝技术制备PEI-C/聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)的低毒复合纳米纤维，考察其纤维性能和细胞毒性；研究改性后的PEI(PEI-C)作为基因载体时在水溶液中与质粒DNA(Plasmid deoxyribonucleic acid, pDNA)之间的相互作用、纳米复合物的形成、载体的生物相容性、细胞毒性及基因复合物在体外的转染等性能。
　　本论文的研究内容主要分为以下几个方面：
　　（1）利用绿色化学的理念，基于富氨基类聚合物对二氧化碳有很强的吸附性这一特点，结合两性离子化合物良好的生物相容性的优势，用二氧化碳对超支化PEI25KDa进行改性，制备出聚乙烯亚胺衍生物(PEI-C)。通过核磁（NMR）、元素含量检测和傅氏转换红外线光谱分析仪（FT-IR）对所制备的衍生物进行表征确认其结构。考察二氧化碳吸收时间、PEI反应浓度等影响因素，结果表明：PEI浓度控制在20％~40％之间；当二氧化碳在通入0.5h后，PEI中氧元素含量已达到27％。MTT细胞毒性实验表明，与未修饰的PEI25K相比， PEI-C材料的细胞的相对存活率维持在80％左右；而PEI的细胞毒性随其浓度增加，细胞存活率从80％左右降低到30％以下，表明PEI-C的细胞毒性显著降低。
　　（2）采用静电纺丝手段，将PEI-C和PVA制备成具有良好纤维形貌的含不同比例的PEI-C/PVA复合纳米纤维，用戊二醛蒸汽交联得到水稳定的纳米纤维膜。扫描电子显微镜（SEM）、FT-IR等手段表征其纤维膜交联前后的形貌及结构变化。通过对纺丝液浓度、电压、接收距离和流速等条件的优化，得到了具有良好纤维形貌的含不同比例的PEI-C/PVA复合纳米纤维支架。以雪旺细胞（schwann cell）为模型细胞来研究该材料的生物相容性。研究表明，雪旺细胞在PEI-C/PVA复合纤维支架表面分布相比未改性的PEI/PVA复合纤维基质更为密集，细胞形态明显较好，更利于细胞生长；MTT细胞毒性实验进一步表明，PEI-C/PVA在质量比为35：65时，纤维支架细胞的OD值为0.47，相当于同等条件下PEI/PVA纤维支架OD值的2倍，证实改性后的复合纤维支架的细胞毒性明显降低。
　　（3）将所制备的PEI-C材料用于介导基因转染的研究。蛋白吸附实验表明二氧化碳修饰后的PEI-C材料抵御蛋白质吸附的能力增强；脱氧核糖核酸酶I的防护和释放实验表明，PEI-C载体材料有保护pDNA免受细胞中核酸酶降解并且可以释放pDNA。使用凝胶电泳仪考察载体与pDNA的结合能力，采用动态光散射(DLS)和Zeta电位仪考察载体与pDNA形成的复合物的粒径和电位。MTT细胞毒性实验表明，与未修饰的PEI载体基因复合物(pDNA/PEI)相比，PEI-C载体基因复合物(pDNA/PEI-C)的细胞毒性显著降低；体外转染实验表明，PEI-C能够有效地介导基因转染。以Hepa1-6细胞和QBC939细胞为模型细胞，在有血清情况下，PEI-C作为载体时在Hepa1-6细胞和QBC939细胞的转染率为33％以上达到甚至高于PEI25KDa作为载体时的转染效率。随着N/P的增加，转染效率从33％左右增长到62％左右；在无血清情况下转染，其PEI-C作为载体在两种癌细胞的转染效率也维持在20％以上，比PEI25KDa作为载体时的转染效率高2.5倍左右，激光共聚焦图片也与其吻合。实验结果表明PEI-C能够有效地介导基因转染。

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第一章 绪论

1.1 引言

1.2聚乙烯亚胺及其衍生物

1.3 纳米纤维膜用于模拟细胞外基质

1.4 介导基因转染

1.5 本课题的提出及主要研究内容

第二章 聚乙烯亚胺衍生物的制备及表征

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 总结

第三章 PEI-C/PVA复合纳米纤维的制备及表征

3.1 前言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4本章小结

第四章 PEI-C/pDNA复合体的制备及在转染方面的应用

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

硕士期间发表的论文和专利

致谢