胶原/乳酸-己内酯共聚物双层管状支架的制备及其组织再生

摘要

现在，纳米生物材料正处于迅猛发展的时期。静电纺丝技术是制备纳米生物材料的有效方法，正在吸引越来越多研究者的关注。静电纺纳米纤维膜的结构类似于细胞外基质的结构，这种结构有利于细胞在上面的粘附和增殖。但是，静电纺纳米纤维膜不适合细胞的三维长入，在应用于病损组织修复时存在一定的局限性。把纳米纤维加捻在一起可以得到纳米纱，纳米纱的表面具有纳米纤维膜的结构特征，可以仿生细胞外基质。把纳米纱加工成膜，就可得到具有较大孔径和较大孔隙率的纳米纱支架。这种支架的孔隙率比纳米纤维膜的要大一些，孔径的大小和细胞直径在同一数量级。纳米纱支架上的孔是由纤维之间的沟壑形成的，这些孔几乎都是连续的，从而能使细胞在支架内部深度渗入。
　　本研究中，我们首先通过传统静电纺丝工艺，制备了P(LLA-CL)纳米纤维支架和胶原蛋白(COL)含量不同的 COL/P(LLA-CL)纳米纤维支架，研究了它们的基本性能，发现胶原蛋白的加入会降低纤维的直径和支架的力学性能；当胶原蛋白含量为25％时，支架表现出了一定的亲水性。通过动态流体静电纺丝工艺，我们制备得到了平行排列的 P(LLA-CL)纳米纱支架（NYS-P）和 COL/P(LLA-CL)纳米纱支架（NYS-CP）。两者都是由较粗的纤维构成，纤维和纤维之间存在沟壑。不同的是，含有胶原蛋白的NYS-CP支架的单根纤维上，可以看到较多的向外延伸的纳米纤维，这种特殊的结构，可以较好地仿生细胞外基质，有利于细胞的粘附。结合前期的研究，我们采用传统静电纺丝工艺和动态流体静电纺丝工艺，使用胶原蛋白含量为25%的COL/P(LLA-CL)共混物制备出了内径为4mm左右的双层管状支架（BLTS），这种支架的外层是疏松的纳米纱层；内层是致密的纳米纤维层。用SEM观察支架的横截面，发现内外层的分界面比较清晰，两者结合得也比较紧密。力学性能测试结果显示，管状支架结合了内外层的各自特点，表现出了良好的力学性能。
　　体外生物相容性测试以猪髋内皮细胞（PIEC）和小鼠成纤维细胞（L929）为种子细胞。MTT结果表明，胶原蛋白的加入可以增加支架的生物相容性；细胞在纳米纱支架上的增殖速度比在纳米纤维支架上的要快一些，这是因为纳米纱支架具有较大的孔隙率，能提供给细胞更大的生长空间。细胞粘附实验和生长形态的观测结果表明，内皮细胞经过6个小时就可以粘附到COL/P(LLA-CL)纳米纤维支架上；经过24个小时，细胞就能完全在支架上伸长开，表现出了良好的生长形态；经过4天，细胞已经互相长在了一起，形成了内皮组织类似物；经过7天，内皮细胞长成了一厚厚的组织。兔子体内生物相容性实验结果表明，纳米纱支架的大孔结构很适合细胞的深度长入和组织的再生。
　　我们从大鼠活体中分离得到了气管上皮细胞和软骨细胞，然后将两种细胞先后种植在BLTS支架上，放置于细胞培养箱里培养7天，发现BLTS支架的外表面生成了软骨类似物。把种有细胞的BLTS支架包埋于健康SD大鼠的气管筋膜内2周，进行预血管化处理。然后把预血管化的BLTS支架、只种有细胞的BLTS支架、未经任何处理的BLTS支架原位移植到了大鼠体内的气管缺损。HE切片结果表明：细胞均可以长入到各组BLTS支架的纳米纱层，且经过预血管化处理的BLTS支架更有利于组织的再生，还可以使支架保持较好地形状。流式细胞检测结果表明：经预血管化处理的BLTS支架在大鼠体内的免疫原性明显降低。CK免疫荧光和特殊染色实验表明：上皮细胞在经预血管化处理的BLTS支架上的生存状态较好，合成了上皮角蛋白抗原CK，预血管化处理后的支架更有利于组织再生。

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第一章 引言

1.1生物医用材料和组织工程简介

1.2血管组织工程

1.3气管组织工程

1.4纳米纱支架在组织工程中的应用

1.5本课题的研究目标与内容

第二章 胶原蛋白/乳酸-己内酯共聚物双层小口径管状支架的制备及其表征

2.1引言

2.2 实验部分

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第三章 纳米纤维和纳米纱支架在体外及体内的生物学研究

3.1 引言

3.2 细胞生物相容性体外实验

3.3纳米纱支架的体内实验

3.4 结果与分析

3.5 本章小结

第四章 双层管状支架（BLTS）在大鼠气管移植中的研究

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第五章 结论与展望

5.1实验结论

5.2存在问题

5.3应用展望

参考文献

附录 攻读硕士学位期间科研及发表论文情况

致谢