细菌纤维素(BC)基关节软骨组织修复支架材料的制备及评价

摘要

木醋杆菌（A.xylinum）分泌的细菌纤维素（BC）是目前组织工程应用中最具前景的天然材料之一。因其独特的纤维素成分及其三维纳米纤维网络结构，以水凝胶形式存在的BC被赋予了多种优良的性能，如高力学强度、高吸水和保水性、高比表面积、微观或宏观结构可塑性、生物相容性以及生物可降解性等。通过与临床应用所需的关节软骨支架材料对比，BC显示出极为符合的特性，已被研究者广泛应用于关节软骨组织修复领域。然而，BC单一的纤维素成分和致密的三维纳米纤维网络结构而引起的生物活性低和细胞难以渗入的缺点，限制了BC在该领域的临床应用。尽管国内外已有许多关于BC基支架材料表面理化性质和微观结构改性的报道，但设计的工艺方法仍无法实现规模化生产，且开发的产品性能未能满足临床应用的要求。因此，今后的研究重点为调控BC表面组成成分和三维微观结构，以开发临床应用关节软骨支架材料为目标，建立和完善改性BC基支架材料的工艺路线和体外细胞评价体系。
　　因此，本论文针对现有BC基关节软骨支架材料在表面理化性质和微观结构的改性技术和产品上所存在的问题采取以下解决方法：
　　（1）将A.xylinum接种于糊化藕粉（LRS）发酵培养基中，利用简易的生物合成法制备了BC/LRS复合支架材料，改善了BC作为关节软骨支架材料的生物相容性。研究发现，低浓度的可以提高BC的产率，促进密集纤维丝束在复合支架材料的形成。随着浓度逐渐上升，糊化藕粉反而降低BC的产率，同时改变复合支架材料的微观形态，并产生层状纤维结构。通过XRD、热重以及力学性能测试结果发现，糊化藕粉的添加对BC/LRS复合支架材料的结晶度、热稳定性以及力学性能产生显著的影响。通过体外细胞Live/Dead分析结果表明，BC/LRS复合支架材料具有较高的细胞活性值，意味着藕粉的存在促进了BC基支架材料的细胞生物相容性。而与其他BC/淀粉复合支架材料对比时，可发现BC/LRS复合支架材料能够支撑更多的细胞生长。此外，利用共聚焦显微镜还观察到，经过14d的培植后，关节软骨细胞可在BC/LRS复合支架材料上形成成熟的伸展形态。这些结果表明，利用生物合成法制备的BC/LRS复合支架材料具有可控的物化性能和改良的细胞生物相容性，拓展了BC作为关节软骨修复支架材料的应用前景。
　　（2）通过在BC表面分别引入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和海藻酸钠（SA）两种修饰物质，然后利用仿生矿化法制备了BC/羟基磷灰石（BC/HA）复合支架材料，达到了模拟关节软骨钙化层的细胞外基质（ECM）和缩短BC支架材料矿化时间的目的。结果表明，PVP和SA因所具有的极性基团对Ca2+产生稳定的吸附作用，加速了HA在BC表面的成核，同时缩短了复合支架材料的矿化时间。而利用PVP修饰BC时，所得到的HA晶体为棒状形态。相比之下，经SA修饰后，该晶体呈现理想的球形形貌。通过FTIR-ATR图谱结果显示，在BC/HA复合支架材料上的HA晶体为CO32+离子掺杂型，并类似于人体HA的组成成分。元素分析结果表明 HA在支架材料上的含量随着矿化时间的增长而逐渐上升，尤其是在BC-PVP-SBF和BC-SA-SBF复合支架材料上，其含量值相对较高。同时HA晶体的Ca/P摩尔比处于1.37到1.57之间，表明合成的HA为缺钙型晶相。通过共聚焦显微镜的观察和碱性磷酸酶活性的测试结果表明，关节软骨细胞在BC-SA-SBF支架材料上的能够最早地显现成熟的细胞形态，且具有更好的细胞分化能力。
　　（3）利用新型简单的表面活性剂辅助偶氮二甲酰胺(AC)发泡技术，改造了BC支架材料的致密微孔结构，解决了现有致孔技术难以实现规模化生产的问题。通过借助BC三维网络互穿通道，AC以溶解在碱性水溶液的形式，与BC纤维丝束形成均匀粘附。结果发现，当利用表面活性剂Tween80辅助AC发泡时，可在成型的BC支架材料上构建均一、连续的大孔结构（尺寸大小约为20μm）。相比于纯BC支架材料来说，致孔后的BC支架材料介孔比表面积能够从56.87 m2/g上升至169.86 m2/g，孔隙率从28.3％提高至90.8%，最大吸水率也从997%增长到7611%。通过体外细胞生物相容性分析结果表明，多孔BC支架材料因其孔隙率和孔体积的增加，在细胞培养的过程中能吸取更多的营养液和加速代谢物的传输，促进了植入细胞的生长、分化和繁殖。然而，尽管多孔BC支架材料在孔隙率方面满足了临床应用的要求，但所具有的孔径仍无法达到理想的尺寸大小，因此还需要对BC致孔工艺路线进行重新思考。
　　（4）采用微流体技术制备结构规整和大小均一的琼脂糖微球，并以此作为致孔剂在活性BC基质生物反应器上合成孔径尺寸为300-500μm以及孔结构相互贯穿的三维多孔BC关节软骨支架材料，解决了上述AC发泡致孔工艺难以扩大孔径的缺点以及现有致孔剂滤出法中致孔剂大小均匀性差、支架材料宏观形态不可控的限制问题。结果显示，三维多孔BC支架材料不仅能够实现关节软骨细胞的内部渗入、转移和复制的目标，还能展现出较高的细胞活性值。尤其是经过14 d的培育后，关节软骨细胞能够均匀地分布在整个支架材料上并使其形成活性预移植体。因此基于结合微流体和生物发酵技术的优势，开发了一种新型灵活的BC支架材料致孔技术，实现了BC孔结构尺寸可控筑造以及细胞三维分布生长的目标，拓展了多孔BC支架材料在关节软骨组织修复领域的应用前景。
　　总而言之，本论文通过生物合成法成功制备一系列BC/LRS复合支架材料，简化了工艺流程步骤，调控了复合支架材料的微观结构且改善了支架材料的生物相容性。利用PVP和SA修饰BC表面，通过仿生矿化法制备了BC/HA复合支架材料，提高了HA晶体的成核速度且缩短了复合支架材料的矿化时间。通过模拟关节软骨钙化层的ECM，BC/HA复合支架材料对植入的关节软骨细胞产生良好的生物活性和分化促进作用。为改造BC致密的网络结构，采用表面活性剂辅助AC发泡技术，在成型BC支架材料上构造了稳定均一的大孔结构。相比之前报道的致孔方法，这种新型发泡技术更为简单、有效和高产。将微流体制备的琼脂糖微球作为致孔剂铺散在活性BC基质上，发酵培养2 d后，获得具有孔结构大小为300-500μm且连续贯通的三维BC大孔支架材料。结果发现，关节软骨细胞不仅能够在最初植入过程中渗入到支架材料的内部，还能在培育过程中进行迁移、繁殖并最终形成三维分布。由此我们解决了现今BC基支架材料生物活性低和细胞难以渗入的两大难题，建立了一种可行和系统的BC基关节软骨支架材料制备和评价体系，为其规模化制备及临床应用提供了科学依据。

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第一章 绪论

1.1 前言

1.2 关节软骨组织工程

1.3 关节软骨组织工程支架材料

1.4 细菌纤维素(BC)—新型医用生物材料

1.5 BC在组织工程修复支架材料的改性研究

1.6 课题研究目标、研究内容和拟解决的关键性问题

参考文献

第二章 BC关节软骨支架材料表面理化性质改性研究及其评价

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法与表征手段

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

参考文献

第三章 BC关节软骨支架材料微孔结构的改性研究及其体外细胞培养应用评价

3.1引言

3.2材料

3.3 实验方法与表征手段

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

参考文献

第四章 pBC/LRS-M/HA复合关节软骨支架材料的制备及其综合性能表征

4.1 引言

4.2 材料

4.3实验方法与表征手段

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

参考文献

第五章 全文总结与展望

5.1结论

5.2本文创新点

5.3展望

致谢

附录一 攻读博士学位期间发表的论文及专利