典型抗生素抗性基因在污泥厌氧消化过程中的水平转移机制

摘要

近年来，细菌抗药性问题已成为全球生态环境安全和人体健康领域的一个关注焦点。污水处理剩余污泥是抗生素抗性基因（ARGs）的一个重要储存库和排放源，越来越多的研究发现在污泥资源化土地利用过程中会造成ARGs的广泛散播。有研究表明，遗传物质具有动态变化的属性，随着对生物基因工程的深入研究，水平基因转移对环境中ARGs的传播和扩散已成为研究热点。因此，研究典型ARGs在污泥厌氧消化过程中的演变规律及其水平转移机制，探寻相关的影响因素对控制抗性基因在污泥土地利用过程中的传播扩散具有重要意义。 本研究主要考察剩余污泥厌氧消化过程中典型 ARGs的演变特征，初步分析质粒DNA接合作用、胞外DNA转化作用、噬菌体DNA转导作用对ARGs水平转移的作用影响。同时通过对比不同因素对目标基因水平转移演变行为的影响，优化确定ARGs最佳去除的工艺条件参数，以期为有针对性的控制和去除ARGs在环境中的进一步传播提供方向和依据。 本研究的主要结论如下： （1）厌氧反应过程中常规指标检测（pH值、氧化还原电位）表明该污泥厌氧消化体系经历了一个稳定运行的过程。温度对厌氧污泥减量化的影响较大，总体削减效果为35 oC<55 oC<变温。三种反应体系pH值均呈现下降趋势，高温时pH的降幅和下降速度相对更小，变温条件下可以获得更低的pH值。随着污泥停留时间（SRT）的延长，挥发性脂肪酸（VFAs）的累积量出现先增加再降低的现象。温度是影响产酸过程的主要因素，中温对正丁酸的生成更有利，高温可以促进乙酸产量增加，变温会促进污泥中VFAs的累积。 （2 ）采用 qPCR 对厌氧污泥中 7 种目标四环素抗性基因（TC-ARGs）（tetA、tetC、tetG、tetM、tetO、tetW和 tetX）、2 种磺胺类ARGs（sulI、sulII）和intI1基因进行检测，所有目标基因在整个厌氧消化过程中均被检出。厌氧过程对抗性基因具有较好的削减效果，磺胺类基因比四环素基因的降幅更高。目标基因在厌氧消化过程中的变化过程受温度和SRT的协同影响。基因削减效果呈现35oC<55 oC<变温的趋势，不同抗性机理的TC-ARGs 在污泥厌氧处理过程中的变化特征各有差异，高温对外排泵基因tetA、tetC和tetG的削减效果更好，而变温对核糖体保护基因tetM、tetO和tetW和酶修饰基因tetX的去除率更高。在整个反应周期内目标基因呈现出先降低后升高的变化趋势，表明延长 SRT 反而不利于基因的有效削减，但是变温处理可以抑制基因丰度的反弹。sulI在不同反应条件下均与intI1基因表现出强烈的正相关关系，但TC-ARGs与intI1基因的相关性表现在特定环境中，尤其反映在变温条件下。 （3）厌氧污泥中各组分有机酸、pH值以及挥发性悬浮固体浓度（VSS）的改变与目标基因的削减呈现一定程度的相关性，但是VFAs与基因的相关性仅体现在中高温环境中，尤其是高温厌氧消化过程，乙酸、戊酸与大部分目标基因均呈现负相关。与之相反，pH值和VSS与部分基因具有正相关关系，tetC和tetG在不同反应器展现出较显著的相关性。增强反应体系的酸度、提高污泥减量化程度可以抑制变温污泥中intI1基因介导抗性基因的水平转移。 （4）较高的温度可以促进由质粒介导的基因接合转移作用，随着 SRT的延长接合作用也会被增强。中温环境下更有利于目标基因以转化的方式进行水平传播和扩散，但是采用变温处理体系可以有效阻碍接合、转化方式的进行。由于噬菌体特殊的结构特征，温度和污泥停留时间对噬菌体基因组的影响并不显著，ARGs 在噬菌体 DNA中可以稳定存在，仅存在于好氧微生物的tetO 基因有较为明显的下降，所以转导作用对遗传信息在不同生物群落的转移发挥重要作用。 （5）通过皮尔逊相关性分析可知，DNA浓度同质粒、胞外、噬菌体中基因的转移效率具有显著的正相关关系。酸性pH易与温度协同作用于基因的水平转移过程，较强的酸性可以抑制三种基因转移方式，尤其表现在变温条件下。对于大部分基因，VSS对削弱基因的传播扩散发挥重要作用。与其他因素相比，VFAs 对反应体系目标基因的影响相对较弱。对比四环素类和磺胺类抗性基因发现，磺胺类基因在胞外和噬菌体DNA中受环境因素的影响更大，但是在质粒中sulI、sulII与VFAs、pH值以及VSS的相关关系相对较弱。

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