负载骨细胞外基质的PLLA/SF仿生纳米纤维支架对人源iPSCs的成骨作用研究

摘要

目前，由于机体对较大面积的骨缺损无法自行愈合，只能借助骨移植手术来实现骨组织的修复与再生。然而，自体骨或异体骨移植等现有的临床方法用于严重骨缺损的治疗仍难以获得满意效果。骨组织工程（bone tissue engineering，BTE）理论上可以完全再生原有骨组织，被认为是修复大面积骨缺损最理想的方法，在未来临床骨损伤治疗上具有广阔的应用前景。本课题研究主要目的为：首先制备负载成骨细胞来源的细胞外基质（osteoblasts-derived extracellular matrix，O-ECM）的聚左旋乳酸/丝素蛋白（Poly (L-lactic acid)/Silk Fibroin，PLLA/SF）静电纺仿生复合纳米纤维支架（O-ECM/PLLA/SF）。其次，将人源诱导性多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）体外诱导为间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），即为 hiPSCs来源的MSCs（hiPSC-MSCs），并将 hiPSC-MSCs 接种于 O-ECM/PLLA/SF上构建一种新型“仿生支架 + 干细胞”BTE 复合体。最后，分别通过体外和体内实验探究复合体体外诱导成骨分化的效果和体内骨缺损修复及再生能力。 静电纺丝（electrospinning）技术是目前为止制备纳米级或亚微米级尺寸纤维支架最为简洁且有效的制备方法。目前 PLLA 纤维支架的力学性能足够用于组织工程领域的研究，但单一的PLLA 纤维支架因亲水性较差，降解缓慢，性脆等缺陷，很难单独使用。SF蛋白由于有良好的生物相容性和优异的亲水性能，被广泛应用于组织工程各领域，但其力学性能不足，无法单独用于骨修复。因此，在仿生支架的选择上，本研究结合静电纺丝技术，将 PLLA 和 SF 进行混纺，以期将两者优异性能相结合，达到优势互补的效果。但研究表明，单纯的复合材料只能从结构上仿生天然细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM），并不能很好的模仿体内微环境，故本研究设计在 PLLA/SF支架上负载 O-ECM的策略来改良复合纳米纤维支架，以期达到在结构和功能上同时仿生的效果。ECM是由细胞分泌的一种三维网架结构，主要成分为各种黏附蛋白和多糖类物质，为细胞的黏附和增殖等提供有利的生长环境。本研究猜想，O-ECM 保留了成骨细胞分泌的ECM 成分，具有极高的生物活性，因此其修饰的PLLA/SF 仿生纳米纤维支架有望能更好地促进干细胞的增殖和成骨分化能力。 种子细胞的选择也是 BTE 应用的关键，本研究采用多能干细胞iPSCs作为研究对象。较成体干细胞MSCs而言，iPSCs具备强大的自我更新能力和多向分化潜能，且取材来源广泛，可由成体细胞直接重编程获得，但因致瘤性、分化不可调控性等问题尚未解决，使其在临床应用上进展缓慢。为此，我们设计将 hiPSCs 诱导为 MSCs（即hiPSC-MSCs）来构建BTE种子细胞，hiPSC-MSCs的获得有望弥补iPSCs和MSCs各自的局限性，既可保持种子细胞较强的增殖活力，又可提高其生物安全性和分化可控性，这使得 hiPSC-MSCs 在 BTE领域具备更好的应用前景和研究意义。 在此背景下，本研究首要工作是制备O-ECM/PLLA/SF仿生纳米纤维支架。首先，采用静电纺的方法制备 PLLA/SF 质量比分别为（100/0、70/30、50/50、30/70和0/100）的共混复合纳米纤维支架，并分别从纤维形貌、直径分布、红外光谱分析、热重分析、力学性能分析、亲水性测试和细胞相容性检测等方面对纤维膜进行表征来探讨其综合性能。结果表明：PLLA/SF=50/50组纤维直径分布最均匀，且直径范围在天然ECM纤维50 ~ 500 nm的范围内。同时，综合红外数据、热稳定性分析、力学性能检测和细胞相容性评价等结果，均表明PLLA/SF=50/50组性能最佳，因此我们选取该组为后续实验所用支架。 其次，我们从新生SD大鼠的颅骨处提取并分离纯化获得了高活性的成骨细胞（rat osteoblasts，rOBs），通过选用P3代的rOBs种植于PLLA/SF共混复合纳米纤维支架上进行培养，利用0.5%Triton X-100和20 mM NH4OH进行脱细胞处理，制备O-ECM/PLLA/SF仿生支架。随后通过扫描电镜观察、细胞免疫荧光染色和 CCK-8 测试等实验分别检测了O-ECM/PLLA/SF的表面形貌、组成成分和细胞相容性。结果表明，脱细胞处理后细胞基本无残留，细胞分泌的纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原等 ECM 主要成分蛋白均匀的附着在支架上，且负载O-ECM的纤维支架能够明显促进细胞的生长。 通过对hiPSCs进行诱导，成功获得hiPSC-MSCs种子细胞。研究发现，培养至P7代的hiPSC-MSCs已达到纯化效果，流式细胞测试结果表明，hiPSC-MSCs中MSCs标记物CD90，CD44和CD29均表达阳性，表达量分别为99.87%，99.87%和99.58%，造血干细胞标志物CD34和CD45均表达阴性（0.85% 和0.87%），与MSCs表面标记物的表达结果相符，且三系分化的实验结果显示成骨、成脂肪和成软骨染色均为阳性。定量PCR结果显示hiPSCs高表达多能干细胞相关基因（NANOG，OCT-4和MSX-1），而hiPSC-MSCs的上述多能基因表达量维持在一个较低水平。我们认为，诱导获得的hiPSC-MSCs综合了iPSCs和MSC细胞的特点，具备自我更新能力强和生物安全性良好等优势。 我们通过将hiPSC-MSCs种植在O-ECM/PLLA/SF仿生支架上进行培养，探讨其体外成骨分化效果。细胞培养14 d后检测成骨相关基因、骨标志性蛋白和骨相关分泌蛋白的表达情况。qPCR检测骨相关基因（ocn，col，alp和runx2）表达、免疫荧光染色检测骨标志性蛋白（OPN和RUNX2）表达、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色（ARS）、ALP定量和COL定量检测分泌蛋白表达等实验结果表明，较其他实验组而言，O-ECM/PLLA/SF组的促成骨分化效果显著，证实仿生支架能体外诱导hiPSC-MSCs的成骨分化。 最后，通过“仿生支架 + 干细胞”复合体植入于构建的大鼠颅骨缺损实验动物模型中来探索其对骨缺损的修复效果。Micro CT 影像学分析、骨密度检测、HE染色、Masson染色和免疫组织化学等手段分别检测4周和8周的缺损部位成骨效果。实验发现，体内植入4周后成骨不明显但已有新血管生成，但8周具有明显的成骨效果。结果显示，含 hiPSC-MSCs的复合体成骨效果比单独植入O-ECM/PLLA/SF 组或单独 PLLA/SF 组的促进骨组织再生的效果要显著。另外，通过在小鼠背部包埋4周检测其异位成骨效果，分别通过X射线和HE染色检测异位成骨功效，印证了上述缺损修复结果，证明构建的“hiPSC-MSCs+O-ECM/PLLA/SF”复合体具备优异的成骨能力。 本研究获得了 O-ECM/PLLA/SF 仿生支架，且创新性地将hiPSC-MSCs与之结合成功构建了“hiPSC-MSCs+O-ECM/PLLA/SF”仿生复合体。实验结果表明，复合体的体外成骨分化和体内骨再生修复能力均效果显著，我们制备的复合体能明显促进干细胞的成骨分化和骨损伤的再生与修复，这将在 BTE研究领域中具有重要的研究前景和临床应用价值。

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