酿酒酵母BSC2功能及参与的真菌AmB耐药机制研究

摘要

两性霉素B（AmB）作为一种多烯类抗真菌药物，其作用机制是与麦角甾醇结合并在细胞膜上形成孔道，造成细胞内小分子外流，导致细胞最终死亡。据报道，AmB耐药主要是细胞质膜麦角甾醇含量变化引起的。在本研究中，我们发现BSC2基因过表达会增加AmB抗性，而酿酒酵母BSC2敲除对AmB极为敏感。但是BSC2诱导的耐药机制仍然不清楚。 我们初步研究发现BSC2并不是通过调控麦角甾醇含量介导 AmB抗性。BSC2过表达与外源抗氧化剂都能恢复bsc2Δ的AmB耐药性，减少AmB诱导活性氧的积累，推测BSC2过表达抗性与活性氧有关。进一步的研究表明，暴露于AmB导致野生型和突变株中超氧自由基（O2·-）和硫代巴比妥酸反应物（TBARS）的水平增加。AmB处理酵母细胞后，胞内的过氧化氢酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性和谷胱甘肽（GSH）含量出现不同程度增加。在BSC2过表达菌株中，SOD，GPX，CAT活性均高于原始菌株BY4741。抗氧化通路的分析表明，BSC2抗氧化作用不依赖于谷胱甘肽合成途径，也不依赖MAPK途径。BSC2主要是通过诱导抗氧化酶活性来减少AmB诱导的细胞氧化胁迫。 致病酵母如白色念珠菌、光滑念珠菌等具有形成生物膜和在酵母菌与菌丝体之间发生形态转化的能力，这与真菌的耐药性密切相关。我们研究发现除了AmB外，BSC2与同源基因IRC23过表达菌株对多种抗真菌剂包括环己酰亚胺、5-氟胞嘧啶（5-FC）、氟康唑(FLU)、卡泊芬净（CAS）和氧化剂过氧化氢均具有抗性。BSC2和IRC23过表达菌株将BY4741的细胞疏水性（CSH）比率从5%分别提高到25%和22%，显著提高了CSH的比率，增加了菌株絮凝能力以及侵入生长能力。通过生物膜含量检测及菌丝观察，我们发现两种过表达菌株均促进生物膜及菌丝的形成。进一步研究证实BSC2并不依赖于几丁质合成通路增加几丁质含量促进生物膜形成。扫描电镜（SEM）显示，chs1Δ，chs3Δ，crh1Δ和cda1Δ突变菌株细胞壁出现了严重缺陷，缺失突变菌株中过表达BSC2细胞会呈卵圆形、细胞壁光滑完整且有生物膜。在卡泊芬净（CAS）处理后，原始菌株及几丁质合成缺失突变菌株细胞表面会变得粗糙、细胞壁有缺陷、细胞异常巨大。BSC2过表达菌株细胞表面轻度粗糙、细胞壁完整且细胞形态大小正常。由此推测BSC2促进生物膜形成保护细胞免受CAS损害。此外，AmB处理细胞，细胞亚显微结构没有发生明显变化，但bsc2Δ突变菌株死亡细胞数及PI染色率均高于BY4741。表明生物膜可能阻碍AmB作用于细胞膜，并维持细胞膜的完整性。以上结果证实了BSC2促进生物膜的形成，阻碍抗真菌剂进入或直接作用于细胞发挥杀菌作用从而保护细胞，形成多药耐药性。 AmB与膜麦角甾醇结合改变细胞膜透性破坏细胞离子平衡而抑菌。我们的实验表明，BSC2过表达可以逆转pmp3Δ和nha1Δ突变菌株的敏感表型，并维持细胞内钠-钾离子平衡，但BSC2不是离子调控基因。外源抗氧化剂NAC并不能恢复AmB造成的细胞内钠-钾离子失衡，推测BSC2维持细胞离子平衡与生物膜形成有关。生物膜的形成与几丁质合成密切相关。酿酒酵母具有3种几丁质合成酶Chs1p，Chs2p和Chs3p，其缺失突变体对AmB及NaCl不敏感。通过构建CHS2过表达质粒，证实CHS2过表达促进生物膜的形成。pmp3Δ和nha1Δ突变体中过表达BSC2或CHS2均能回补菌株对AmB与NaCl的敏感性。我们分别利用AmB与NaCl处理缺失突变体及过表达菌株，通过离子检测发现BSC2或CHS2过表达均能回补pmp3Δ和nha1Δ突变体的离子失衡。利用PI染色检测细胞膜完整性，研究证实CHS2及BSC2均能增强细胞膜的完整性。以上研究证明BSC2通过促进生物膜的形成调控细胞内离子稳态。 综上所述：BSC2通过提高抗氧化酶活性增强对 AmB的抗性，同时促进生物膜的形成、维持细胞离子稳态，具有多药耐药性。

目录

第一个书签之前