基于醇质体/丝素复合纳米纤维构建透皮肿瘤免疫系统及其评价研究

摘要

透皮免疫是一种新型的无针免疫接种方式，克服了传统的注射接种方式存在诸多缺陷，具有广阔的应用前景。醇质体（Ethosomes,Eth）具有优异的透皮性能，课题组前期通过半乳糖修饰成功制备了能够靶向树突状细胞（DCs）的醇质体，并进一步构建了负载该载体的丝素复合纳米纤维膜透皮免疫系统，该系统被证实能有效诱导特异免疫应答反应。本研究拟在此基础上通过引入肿瘤抗原基因疫苗及免疫佐剂构建透皮肿瘤免疫系统，并尝试将其应用于皮肤黑色素瘤的治疗。 酪氨酸激酶相关蛋白2（TRP2）是一种在正常黑色素细胞和黑色素瘤细胞中都表达的保守抗原，TRP2基因疫苗用于黑色素瘤治疗效果显著。卡介苗（BCG）是一种非特异性免疫佐剂，常用于黑色素瘤的免疫疗法。为了更有效的透皮递送TRP2基因疫苗与BCG并靶向DCs 细胞，利用半乳糖化聚乙酰亚胺（PEIGal）对醇质体进行修饰，既保持较高基因转染效率又显著降低载体的细胞毒性。 基于以上认识，本研究联合应用TRP2基因疫苗与BCG，构建了用于治疗黑色素瘤的PEIGal-醇质体/丝素复合纳米纤维透皮肿瘤免疫系统，并对其进行了系列表征和疗效评价研究，主要研究内容和结果如下： （1）PEIGal-Eth载体复合物的制备与表征。以PEIGal对阳离子醇质体进行修饰，得到载体复合物 PEIGal-Eth，该复合物粒径小，表面带有正电荷，包封率高；DNA凝胶电泳实验表明，PEIGal-Eth与质粒DNA的最适N/P比值为20，且质粒DNA负载于PEIGal-Eth可免受DNase酶的降解； （2）PEIGal-Eth体外透皮及靶向转染DCs细胞实验。以GFP基因表达质粒（pGFP）和罗丹明 B（RB）为模型药进行的体外实验表明，PEIGal-Eth具有良好的透皮和靶向转染DCs细胞的能力。进一步的研究表明，负载 TRP2 和 BCG的载体复合物 pTRP2@PEIGal-BCG@Eth ）可诱导DCs成熟相关因子CD11c、CD80和CD86的表达，提示TRP2/卡介苗@PEIGal-Eth可有效促进抗原递呈从而激发免疫应答。 （3）pTRP2@PEIGal-BCG@Eth/SF复合纳米纤维透皮免疫系统的制备及其评价。采用绿色静电纺技术制备 pTRP2@PEIGal-BCG@Eth/SF 复合纳米纤维膜，SEM、纤维荧光术、水接触角及细胞增殖实验表明该膜纳米纤维表面光滑，纤维直径480-600 nm，载体复合物均匀分布于SF纤维上，具有良好的亲水性和细胞生物相容性；体外实验显示，该复合纳米纤维膜具有良好的透皮释药性能，并可诱导促进DCs细胞表面相关成熟因子CD11c、CD80和CD86的表达；经该膜免疫后，小鼠血清TNF-ɑ含量以及脾细胞TNF-ɑ分泌水平显著提高；小鼠荷瘤实验表明，经该膜免疫过的小鼠黑色素瘤生长缓慢（抑瘤率达51.03%），微观组织切片可见瘤内细胞出现了细胞膜融合与细胞核消融现象，证明肿瘤细胞被有效杀灭。 综上所述，本研究所构建的PEIGal-Eth/SF复合纳米纤维膜可有效经皮递送肿瘤抗原基因疫苗诱导 DCs 细胞成熟，从而激发机体对肿瘤细胞的免疫应答反应，达到杀灭肿瘤细胞的目的。本研究为恶性肿瘤的治疗提供了一种新的方案，具良好的开发应用前景。

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