SRSF1在GT1-7细胞模型中参与性发育相关基因转录后调控机制的研究

摘要

性发育是个体成熟并获得生殖能力的过程，受到遗传、营养、环境等多种因素的影响。性发育的调控依赖于一个有多条通路共同组成的复杂基因网络。本课题组前期在近交系小鼠的X 染色体上发现了一个推迟小鼠性发育启动的基因miR-505，实验证明丝氨酸/精氨酸富集的剪接因子1（SRSF1）就是miR-505的靶基因，并且SRSF1能够缓解miR-505对性发育相关基因促性腺激素释放激素（GnRH）、Kiss1的抑制作用。 本研究基于上述背景，在 GT1-7 细胞中，利用短发夹 RNA （shRNA）慢病毒构建低表达SRSF1的稳转株，确定SRSF1与性发育相关基因GnRH、Kiss1之间的关系。利用敲低SRSF1的稳转株和pGT1-7细胞进行RNA测序（RNA-seq）和蛋白质组学的研究，找到SRSF1 参与影响性发育相关基因的信号通路，并初步探索 miR-505和SRSF1影响性发育相关基因的分子机制。 构建SRSF1敲低的稳转株，用包含SRSF1-shRNA载体的慢病毒感染小鼠下丘脑永生化的神经元细胞 GT1-7，获得稳定敲低 SRSF1的细胞株。并检测稳转株中性发育相关基因GnRH、Kiss1的表达量。在mRNA水平，用高通量的测序转录组分析技术——RNA-seq对稳转株进行表达谱检测。并用生物信息学对测序结果进行分析，用TopHat将reads比对到基因组上，比对上的reads经过Cufflinks形成转录本，Cuffdiff 对这些转录本进行分析得到差异表达的基因。后续对这些差异基因进行GO分析和KEGG pathway分析。在蛋白质水平，用高通量筛选技术——稳定同位素标记的相对和绝对定量技术（iTRAQ）对稳转株进行差异蛋白的筛选。并用 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件对差异蛋白进行分子功能、基因网络和信号通路的分析。 Real-time PCR和Western blot检测GT1-7细胞中SRSF1在mRNA和蛋白水平的变化，发现SRSF1敲低效率分别为45%（P<0.001）和42% （P<0.05 ），即 成 功 构 建 了 敲 低 SRSF1的稳 转 株shRNA-SRSF1-GT1-7。稳转株中性发育相关基因 GnRH、Kiss1 在mRNA水平分别降低35%(P<0.01)和46%(P<0.001)。说明SRFS1影响了性发育相关基因的表达。RNA-seq在shRNA-GT1-7-SRSF1细胞中共检测到3161个表达差异的基因，其中上调的有1407个，下调的有1754个。在过表达mir-505的细胞pGT1-7中共检测到3034个表达差异的基因，其中上调的有1357个，下调的有1677个。两种细胞中的差异基因大多数位于细胞质，具有结合、激活的功能。在KEGG分析中，代谢通路、癌症通路、γ-氨基丁酸能突触、PI3K-Akt 信号通路在两种细胞中都被富集到，pGT1-7 细胞的差异基因还参与胰岛素分泌和GnRH信号。iTRAQ在两种细胞中检测到了4945个蛋白质，shRNA-GT1-7-SRSF1中有102个差异蛋白质（fold change 在1.3倍之上，p值小于0.05），pGT1-7中有173个差异蛋白质（fold change 在1.3倍之上，p值小于0.05）。这些差异蛋白有一半以上位于胞质，同RNA-seq。shRNA-GT1-7-SRSF1 中的差异蛋白主要参与 γ-氨基丁酸降解的信号通路、胰岛素受体信号通路及AMPK信号通路。在pGT1-7细胞中γ-氨基丁酸降解的信号通路和PI3K-Akt 信号通路被富集到。通过Real-time PCR验证，说明RNA-seq和iTRAQ的结果较为可靠。综上所述，我们推测 SRSF1 可能是通过 γ-氨基丁酸降解信号通路、AMPK信号通路和PI3K-Akt 信号通路发挥功能。这个研究为后续更深入的解析SRSF1影响性发育的分子机制研究提供一个理论基础。

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