两种不同分离、纯化方法对SD大鼠BMSCs生物学特性影响的研究

摘要

目的:
　　 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种存在骨髓中,来源于中胚层,且具有多向分化潜力的成体干细胞。在特定的诱导条件下可以向中胚层来源的各种细胞,如成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞分化。近年来随着对BMSCs的深入研究,发现BMSCs也具有跨胚层分化的潜能,BMSCs移植入活体的中枢神经系统内可以存活并可分化为神经元细胞、神经胶质细胞,体外实验已证实在一定的诱导条件下BMSCs向神经元细胞、神经胶质细胞转化,可不同程度的改善颅脑损伤、脑卒中等疾病的神经功能的缺损状态。因此,BMSCs是一种十分理想的移植治疗神经系统疾病的细胞,具有十分重要的临床应用价值与前景。本研究目的就是探讨通过比较观察使用①密度梯度离心提取+胎牛血清贴壁培养法②全骨髓胎牛血清贴壁培养法这两种方法提取、培养SD大鼠的骨髓间充质干细胞的细胞形态、生物学特性、细胞表型等生长增殖和生物活性各方面有无差异,从而评价两种方法的优势与劣势,以期待寻找一种更好的提取、培养骨髓间充质干细胞的方法。
　　 方法:
　　 在无菌的条件下用密度梯度离心法与全骨髓分别提取4-6周龄的SD大鼠的左、右下肢的BMSCs,继而用含有10％胎牛血清的LG-DMEM(低糖DMEM)培养扩增BMSCs。用密度梯度离心提取出的原代BMSCs再经胎牛血清贴壁培养法传代后可得到较纯化的可大量扩增的BMSCs细胞系(得到的细胞为A组);无菌条件下取全骨髓在胎牛血清中贴壁培养后经换液、传代也可得到大量的BMSCs(得到的细胞为B组)。流式细胞仪检测密度梯度离心法与全骨髓两种方法提取培养的细胞的CD29+,CD44-,CD45-的表达,鉴定所培养的BMSCs,绘制BMSCs的生长曲线,并比较两组BMSCs的细胞形态、冻存复苏BMSCs后存活率和生长状态等。
　　 结果:
　　 1.A组与B组的BMSCs生物性状皆较稳定,初培养时细胞皆为圆形,传代稳定后细胞呈BMSCs典型的梭形,并以漩涡状排列成长;有典型的特征性的贴壁生长;
　　 2.经流式细胞仪检测A组与B组的BMSCs细胞表面标记物:CD29+CD44-CD45-,结果A组CD29+(93.24％),CD44-(94.90％),CD45-(94.22％);B组CD29+(92.89％),CD44-(96.70％),CD45-(93.10％),均符合BMSCs的特征;
　　 3.A组与B组BMSCs均贴壁生长,原代台盼蓝染色检测细胞活性A组(-x)为89.19％,贴壁法(B组)x为95.27％,并使用统计学软件SPSS16.0进行统计学分析,差异存在统计学意义;
　　 4.A组细胞生长特性:BMSCs贴壁生长,原代培养10天达到90％融合,传代后的BMSCs增殖速度较原代(P0)培养增快,第三代(P3)的BMSCs已基本纯化,BMSCs呈典型的梭形,旋涡状排列生长,随着传代,细胞增殖分化能力减弱;B组细胞不同于A组在于:P0细胞为全骨髓细胞,换液,传代过程是大幅度纯化的主要方法,第四代(P4)细胞镜下观察才可达到基本纯化,但得到的细胞的活性却强于A组。
　　 结论:
　　 1.密度梯度离心提取和全骨髓胎牛血清贴壁培养这两种方法提取、培养的细胞经流式细胞仪进行表面标志物鉴定符合BMSCs的特征;获得的BMSCs纯度较高,在显微镜下观察两组BMSCs的形态及生长状态相似;
　　 2.密度梯度离心提取间充质干细胞细胞活力低于全骨髓法(存在统计学差异),这种差异可能与过程中的多次离心及洗涤对细胞造成丢失及损伤等原因有关;
　　 3.全骨髓法与密度梯度离心提取法相比操作简单,花费较小,密度梯度离心提取法适于短时间内要求得到纯度较高的间充质干细胞细胞。