表皮细胞培养中维持干细胞特性相关技术的研究

摘要

目的：（1）利用流式细胞仪检测表皮细胞整合素β1亚基（CD29）和增殖细胞核抗原（PCNA）的荧光标记强度,建立简便易行的表皮干细胞检测方法.（2）利用该检测手段,通过优化表皮细胞分离、培养条件,以提高培养表皮细胞中的干细胞数量.（3）构建人整合素β1基因重组腺病毒载体,转染表皮细胞,观察其生物学特征的改变,为进一步皮肤组织工程研究提供理论基础和研究手段.方法：（1）分离表皮细胞,通过粘附选择富集表皮干细胞和短暂扩充细胞,观察细胞克隆形成率,流式细胞仪检测表皮细胞CD29和PCNA、荧光免疫组织化学检测BrdU的荧光标记强度,分析上述指标间的相关性.（2）利用L16（4<'4>）正交表设计试验,选择原代培养消化过程中DispaseⅡ酶与胰蛋白酶不同浓度和作用时间,以及无血清培养基中EGF、胰岛素、霍乱毒素、氢化考的松的不同浓度为实验因素,考察表皮细胞生物学性状和其中CD29<'+>/PCAN<'->细胞的比例,优化最佳分离和培养条件.（3）利用AdeasyTM系统构建含ITG-β1基因片段的重组腺病毒载体,转染人原代培养表皮细胞,观察细胞克隆形成率和CD29<'+>/PCAN<'->细胞的比例.结论：（1）CD29<'+>/PCAN<'->细胞比例与鉴定干细胞的基本指标BrdU阳性率及细胞周期均具有良好的相关性,可以作为表皮干细胞的检测指标.（2）对于原代表皮细胞分离培养,0.125﹪ DispaseⅡ酶冷消化10h,0.1﹪胰蛋白酶37℃消化30min,培养体系中EGF、胰岛素、霍乱毒素、氢化考的松分别取20ng/ml、5μg/ml、8.4ng/ml、0.2μg/ml浓度时,原代表皮细胞中干细胞比例最高.（3）成功构建了携带ITG-β1基因片段的重组腺病毒载体,转染人表皮细胞后,能增强细胞的增殖能力,增加表皮细胞内干细胞比例.

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

前言

实验一表皮干细胞检测方法的建立

1.材料与方法

2.实验结果

3.讨论

参考文献

实验二表皮细胞分离条件的优化

1.材料与方法

2.实验结果

3.讨论

参考文献

实验三表皮细胞培养条件的优化

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

参考文献

实验四ITG-β1基因重组腺病毒载体的构建及表皮细胞转染

1.材料方法

2.结果

3.讨论

参考文献

小结

致谢

文献综述

提要