腺病毒介导PTEN和TIMP-2抑制人脑胶质瘤U87的实验研究

摘要

研究目的:构建携带PTEN和TIMP-2基因的Adeno-PTEN和Adeno-TIMP-2重组腺病毒载体,探讨PTEN和TIMP-2对人脑胶质瘤的恶性表型的影响,包括细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、侵袭和血管生成等方面,尤其是二者在侵袭和血管生成方面是否具有协同作用,同时探讨PTEN与TIMP-2的抗胶质瘤作用机制,为AdPTEN和AdTIMP-2重组腺病毒应用于人脑胶质瘤细胞的基因治疗提供实验依据.研究内容:(1)采用分子生物学技术,将目的基因从质粒载体上酶切下来,装入穿梭质粒pTRE-Shuttle,用PI-SceI、I-CeuI行双酶切后,与Adeno-DNA骨架连接,构建成重组腺病毒DNA.用PCR方法鉴定目的基因是否成功装入.PacⅠ酶切线性化后,以Lipofectamine转染293细胞,包装出有感染力的复制缺陷型重组腺病毒,并在293细胞中进行扩增,采用空斑形成实验确定病毒滴度;(2)用构建的重组腺病毒感染人脑胶质瘤U87,采用RT-PCR和Western blot、ELISA方法从mRNA和蛋白水平检测目的的基因的表达;用MTT试验检测PTEN与TIMP-2基因对肿瘤细胞增殖的作用;用流式细胞仪检测目的基因对肿瘤细胞的细胞周期与细胞凋亡的影响;用明胶酶谱检测转染目的基因后人脑胶质瘤U87细胞中MMP-2与MMP-9酶活性的变化;用Boyden侵袭小室检测转染目的基因后U87细胞体外侵袭力的变化;用MTT法检测感染腺病毒的U87细胞上清对人脐静脉内皮细胞ECV-304的抑制作用;同时检测它对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的作用;(3)PTEN与TIMP-2基因处理U87细胞后,植主裸鼠颅内形成脑内胶质瘤动物模型,观察携带目的基因的腺病毒对肿瘤生长的影响.并用免疫组化法检测肿瘤组织中MMP-2、Ⅷ因子相关抗原、PTEN和TIMP-2的表达.研究结论:采用分子生物学技术,成功构建重组腺病毒载体AdPTEN和AdTIMP-2.体内外实验证实PTEN和TIMP-2基因对人脑胶质瘤U87有明显的抗肿瘤作用,表现在肿瘤增殖作用、细胞周期调控、体外侵袭力和血管生成的抑制等方面;这可能通过下调MMP-2与MMP-9的表达与活性而实现的,在抗肿瘤增殖、调控细胞周期和肿瘤血管生成等方面二者无明显抑同作用.PTEN和TIMP-2二者对体外侵袭力的抑制有协同作用,而MMP活性的改变与之不同步,这表明存在其它的信号通路参与PTEN对U87的侵袭力的调控作用.这表明AdPTEN、AdTIMP-2能抑制人脑胶质瘤的多种恶性表型,通过进一步研究它们有可能成为治疗胶质瘤的一种有效方法,尤其是在抗胶质瘤侵袭治疗方面.该实验为胶质瘤的抗侵袭治疗提供新的思路和方法.

目录

英文缩写词表

前 言

第一部分腺病毒载体Adeno-PTEN和Adeno-TIMP-2的构建

材料与方法

结 果

附图

讨 论

参考文献

第二部分腺病毒介导PTEN和TIMP-2基因对人脑胶质瘤U87作用的体外实验研究

材料与方法

结 果

附图

讨 论

参考文献

第三部分腺病毒介导PTEN和TIMP-2基因对人脑胶质瘤U87作用的体内实验研究

材料与方法

结 果

附图

讨 论

参考文献

总 结

综述一 PTEN基因与胶质瘤的研究进展

综述二 TIMPs与胶质瘤的研究进展

博士期间发表的论文

致 谢