血小板源生长因子受体α在瘢痕疙瘩形成中的作用机制

摘要

目的：研究血小板源生长因子受体α(PDGFR-α)在瘢痕疙瘩形成中的作用及其内在机制。方法：检测PDGFR-α在体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达，并与正常皮肤成纤维细胞作对照；观察PDGFR-α对细胞增殖和胶原合成的影响；观察PDGFR-α激活对细胞内ERK通路激活的诱导。结果：PDGFR-α在体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达显著高于正常皮肤成纤维细胞，这种高表达显著促进成纤维细胞增殖和胶原合成，PDGFR-α激活后主要通过细胞内ERK通路来传递促细胞增殖和胶原合成的信号。结论：PDGFR-α高表达对促进瘢痕疙瘩形成有重要意义。 一、研究背景瘢痕疙瘩是人类特有的一种病理现象，其造成的外形破坏和功能障碍是目前整形外科治疗中急待解决的难题。其形成机制复杂，虽然国内外学者已从多方面对瘢痕疙瘩进行了广泛的研究，但其病因机制仍不清楚。现已确定瘢痕疙瘩是以成纤维细胞旺盛增殖和以胶原为主的细胞外基质过度合成、沉积为特征的纤维化疾病，而且发现多种促纤维化细胞因子在瘢痕疙瘩的形成中起重要作用。血小板源生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)是体内一种主要促有丝分裂剂，可以刺激成纤维细胞、平滑肌细胞等多种组织细胞增殖、趋化及迁移，与肺纤维化、肾小球肾炎、硬皮病等多种纤维化疾病都密切相关。PDGF是由多种异构体组成的家族，通过特异性结合并激活靶细胞膜上的血小板源生长因子受体(platelet-derivedgrowthfactorreceptor，PDGFR)而发挥作用，PDGFR是一种跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，可分为α、β两种亚基，PDGFR-α和PDGFR-β结构相似，但在不同种类细胞中的表达却存在很多差异性，在细胞中的表达水平也不恒定，在体内介导的功能之间的差异性更为明显。已有报道瘢痕疙瘩成纤维细胞对PDGF促细胞增殖和胶原合成的反应性都高于正常，这种高反应性可能是由瘢痕疙瘩成纤维细胞受体水平升高所介导，但具体机制不明，不同研究对于瘢痕疙瘩成纤维细胞中是否存在PDGFR表达增高、何种受体表达增高等都存在分歧。 近年来，随着现代细胞生物学和分子生物学的发展，病理性瘢痕增生与细胞信号转导关系的研究也逐渐受到人们重视。细胞信号转导是指细胞外的刺激信号通过细胞膜和细胞内的一系列信号分子和生化级联反应传导到细胞内的靶分子，进而发生细胞增殖、分化、凋亡、粘附及物质合成等生物学效应的一系列生物活性反应过程。生命过程就是以细胞信号转导为基础的生物化学反应过程，创伤后病理性瘢痕增生是由于参与修复的细胞增殖大于凋亡、细胞外基质合成大于降解而形成的，这必然涉及细胞对各种刺激的反应－细胞信号转导过程。现已开展关于恶性肿瘤、动脉粥样硬化等许多疾病发生过程中PDGF及其受体家族信号转导方面的研究，但对于瘢痕疙瘩形成过程中PDGF及其受体家族信号转导方面的研究却还是空白。 二、研究目的 (1)检测PDGFR-α、PDGFR-β在体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞中蛋白及mRNA水平的表达。 (2)检测PDGFR-α在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达升高对成纤维细胞增殖及胶原合成的影响。 (3)检测PDGFR-α磷酸化对成纤维细胞内ERK通路的激活情况以及ERK通路激活对成纤维细胞增殖及胶原合成的影响。 (4)了解PDGFR-α在瘢痕疙瘩形成中的作用机制，为探索新的防治方法提供思路。 三、研究内容和方法(1).切取瘢痕疙瘩标本和包皮正常皮肤标本进行成纤维细胞原代培养，将第3代细胞用于实验，分别采用免疫细胞化学、实时定量PCR和westernblot方法检测了PDGFR-α、PDGFR-β在蛋白质及mRNA水平的各自表达。 (2)应用不同浓度的PDGFR-α刺激剂PDGF-AB对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞进行干预处理，并分别通过MTT和3H脯氨酸掺入法检测两组成纤维细胞增殖和胶原合成。 (3)应用不同浓度的PDGFR-α抑制剂AG1296对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞进行干预处理，并分别通过MTT和3H脯氨酸掺入法检测两组成纤维细胞增殖和胶原合成。 (4)采用westernblot方法分别检测PDGF-AB刺激后瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞中PDGFR-α及ERK通路关键酶MEK、ERK1/2、Elk-1的磷酸化水平。 (5)应用不同浓度的选择性ERK磷酸化抑制剂PD98059对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞进行干预处理，通过MTT和3H脯氨酸掺入法检测细胞增殖和胶原合成。 四、研究结果 (1)免疫细胞化学染色显示瘢痕疙瘩成纤维细胞中的PDGFR-α和PDGFR-β的染色较正常皮肤成纤维细胞增强，PDGFR-α的染色增强尤其明显。图像定量分析显示瘢痕疙瘩成纤维细胞中PDGFR-α表达的阳性指数显著大于正常皮肤成纤维细胞，而瘢痕疙瘩成纤维细胞中PDGFR-β表达的阳性指数与正常皮肤组成纤维细胞比无显著性差异。通过比较westernblot的积分光密度值，显示PDGFR-α在瘢痕疙瘩成纤维细胞中蛋白表达显著高于正常皮肤成纤维细胞，而PDGFR-β在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的蛋白表达与正常皮肤成纤维细胞相比未见显著升高。通过比较实时定量PCR每百万看家基因含量，显示与正常皮肤组成纤维细胞相比，瘢痕疙瘩成纤维细胞中PDGFR-α的mRNA表达显著升高，而PDGFR-β的mRNA表达升高不显著。 (2)通过MTT和3H脯氨酸掺入法检测，显示在无PDGF-AB干预条件下，瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和胶原合成都显著高于正常皮肤成纤维细胞。PDGF-AB以剂量依赖方式增加两组成纤维细胞的细胞增殖和胶原合成，PDGF-AB对瘢痕疙瘩成纤维细胞的饱和浓度明显高于正常皮肤成纤维细胞，两组成纤维细胞增殖和胶原合成差异随着PDGF-AB浓度的增加而扩大。 (3)通过MTT和3H脯氨酸掺入法检测，显示在无AG1296干预条件下，瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和胶原合成都显著高于正常皮肤成纤维细胞。AG1296以剂量依赖方式减少两组成纤维细胞的细胞增殖和胶原合成，但AG1296对瘢痕疙瘩成纤维细胞的饱和浓度明显高于正常皮肤成纤维细胞，经一定浓度AG1296作用后可以消除两组成纤维细胞增殖和胶原合成之间的差异。 (4)通过westernblot检测，显示PDGF-AB刺激以剂量依赖方式升高PDGFR-α及ERK通路3个关键酶MEK、ERK1/2、Elk-1的磷酸化水平，而且在同等浓度PDGF-AB刺激下瘢痕疙瘩成纤维细胞中PDGFR-α及上述酶的磷酸化水平显著高于正常皮肤成纤维细胞。 (5)通过MTT和3H脯氨酸掺入法检测，显示PD98059以剂量依赖方式抑制PDGF-AB诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞增殖，但PD98059对瘢痕疙瘩成纤维细胞的饱和浓度高于正常皮肤成纤维细胞。PD98059以非剂量依赖方式抑制PDGF-AB诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞胶原合成。 五、研究结论瘢痕疙瘩成纤维细胞中PDGFR-α的mRNA和蛋白表达水平都显著高于正常皮肤成纤维细胞，而两组成纤维细胞中PDGFR-β的表达则无显著性差异。瘢痕疙瘩成纤维细胞中PDGFR-α的高表达可结合更多的PDGF配体从而可介导更强的促成纤维细胞增殖和胶原合成的刺激，对瘢痕疙瘩的形成具有重要影响。PDGFR-α结合PDGF配体后发生磷酸化并激活细胞内的ERK通路，瘢痕疙瘩成纤维细胞中PDGFR-α的高表达引起其细胞内ERK通路各关键酶的磷酸化水平相应高于正常皮肤成纤维细胞，而ERK通路激活显著促进细胞增殖并参与胶原合成过程。

目录

文摘

英文文摘

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中英文缩写对照

前言

第一部分 PDGFR-α和PDGFR-β在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达

第二部分 PDGFR-α高表达对成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

第三部分 PDGFR-α磷酸化与细胞内EPK信号通路的关系研究

全文总结

综述一:血小板源生长因子及其受体的结构与功能

综述二:血小板源生长因子及其受体信号转导通路研究进展

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