CD40LsiRNA阻断CD40/CD40L受体配体轴抗动脉粥样硬化的研究

摘要

CD40LsiRNA阻断CD40/CD40L受体配体轴抗动脉粥样硬化的研究CD40与CD40L结合后通过调节大量细胞因子、趋化因子、粘附分子、生长因子和基质金属蛋白酶等物质的表达促进AS相关的炎症、免疫反应，诱导粥样斑块发生、进展，增加斑块的易损性。RNAi是一种新兴的基因沉默技术，具有高特异性、高效性、简便易行的特点。首先在体外实验中筛选出RNAi的有效作用靶点。在筛选出有效靶点的基础上应用三质粒包装系统构建CD40LsiRNA慢病毒载体。 建立大鼠AS模型：高脂饮食+导丝损伤颈动脉内膜。处理后4周，血管腔内注入慢病毒，继续高脂喂养3周后取材。结果表明，构建的慢病毒载体可有效降解CD40LsiRNA，抑制大鼠对CD40L的表达，并进一步减少TF和MMP-9的合成，减少动脉粥样硬化斑块的形成并限制其进展进展，为安全、有效预防和治疗动脉粥样硬化及其并发症开辟了新的途径。 研究背景、目的近年来CD40和CD40L对动脉粥样硬化发生和斑块稳定性的影响日益引起人们的重视。CD40与CD40L均为跨膜蛋白，最初分别发现于B淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞表面，是CD4+T介导的细胞免疫和B细胞增殖、分化，以及抗体产生、类型转化的重要调节成分。此后的研究证实，CD40与CD40L在AS病变的主要相关细胞(巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞)中均有表达。CD40与CD40L结合后通过调节大量细胞因子、趋化因子、粘附分子、生长因子和基质金属蛋白酶等物质的表达促进AS相关的炎症、免疫反应，诱导粥样斑块发生、进展，增加斑块的易损性。临床研究发现，与正常对照组及稳定性心绞痛组相比，不稳定性心绞痛和急性心梗患者血清sCD40L水平显著升高。病理研究进一步证实，粥样硬化斑块局部，尤其在斑块易破裂的肩部CD40和CD40L的表达明显增多；另外，体内sCD40L与血小板活化程度及促凝状态呈正相关，CD40/CD40L受体配体轴可以促进血栓的形成。 体内外试验发现，部分血管紧张素受体拮抗剂、他汀类药物与GPⅡb/Ⅲa拮抗剂可减少CD40或CD40L的表达，阻断CD40/CD40L受体配体轴，其降压、调脂、抑制血小板以外的抗AS作用很可能就来源于此。大量事实表明，阻断该受体/配体轴有可能成为减少粥样硬化斑块形成，预防斑块不稳定与破裂的有效治疗途径。 以往，国内外研究者曾运用单克隆抗体、重组腺病毒载体等方法抑制CD40/CD40L的作用，但因免疫源性、生物毒性、操作复杂等原因未能推广应用。 RNAi是一种新兴的基因沉默技术，具有高特异性、高效性、简便易行的特点，为安全、有效地阻断CD40/CD40L受体/配体轴提供了新的希望。 方法1.本研究根据已知的大鼠CD40LmRNA序列和通用的siRNA设计原则，通过化学合成针对CD40LmRNA三个靶点的siRNA，构建CD40L-GFP(荧光蛋白)重组质粒载体，在体外实验中共转染293-T细胞，根据荧光强度(即GFP表达量)判断抑制作用的优劣(干扰作用强的序列同时减少荧光蛋白的表达量)，从而筛选出干扰效果最佳的mRNA靶点：针对746靶点5'GAATTGGCTTCTCATCTAT3'。 2.在筛选出有效靶点的基础上应用三质粒包装系统构建CD40LsiRNA慢病毒载体，主要步骤：PCR合扩增双链DNA、线性化后扩增、测序鉴定、病毒包装、测定病毒滴度。 3.在构建慢病毒表达载体的同时建立Wistar大鼠AS模型：高脂饮食喂养2周后测血TC、LDL-c浓度，证实形成高脂血症后以导丝损伤颈动脉内膜，持续高脂喂养。手术处理后4周血管腔内注入慢病毒：结扎曾损伤的血管，病毒作用15分钟左右，以0B胶修复血管，松开血管夹。继续高脂喂养3周后取材。通过观察冰冻切片的荧光强度判断慢病毒的转染效率(载体上连有GFP)；采用血清学、免疫组织化学、及荧光定量聚合酶链式反应等方法，从基因、蛋白和组织水平证实了CD40LsiRNA慢病毒载体抑制CD40L基因表达的作用；另外，测定血清TF水平，用免疫组织化学的方法显示颈动脉局部基质金属蛋白酶-9的表达量。 结果筛选出RNAi有效靶点后，成功构建了表达大鼠CD40LsiRNA的慢病毒载体，建立了Wistar大鼠动脉粥样硬化模型。颈动脉冰冻切片显示，绿色荧光强度明显，均匀分布于内膜和中膜。与模型组及非特异siRNA慢病毒对照组相比，siRNA组CD40LmRNA和可溶性蛋白水平显著降低，血管局部CD40L免疫组织化学染色明显变浅；血清TF浓度以及斑块局部基质金属蛋白酶9表达量显著减少。 结论我们的研究表明，构建的慢病毒载体可有效降解CD40LsiRNA，抑制大鼠对CD40L的表达，并进一步减少TF和MMP-9的合成，减少动脉粥样硬化斑块的形成并限制其进展进展，为安全、有效预防和治疗动脉粥样硬化及其并发症开辟了新的途径。

目录

文摘

英文文摘

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英文缩略语

前言

第一部分化学合成siRNA和有效靶点的筛选

第二部分构建CD40LsiRNA慢病毒表达载体

第三部分CD40LsiRNA慢病毒载体系统抗大鼠动脉粥样硬化的研究

参考文献

RNA干扰在心血管系统的应用

致谢