FHIT基因辐射损伤及其转染对肿瘤细胞放射敏感性影响的基础研究

摘要

电离辐射是一把双刃剑。一方面，电离辐射是最常见的物理致癌因素之一，随着核能在国民经济和军事领域中的应用越来越广泛，电离辐射对人类潜在的危害也不断增加。在基因水平阐明辐射生物学效应的机理，是放射生物学、肿瘤学、预防医学与辐射防护学研究的重点。其研究成果涉及国民健康、能源利用、环境与战争，因而具有重要的社会、军事、经济与政治意义。另一方面，放射治疗是治疗肿瘤的三大主要方式之一。肿瘤放射治疗是利用放射线，如放射性同位素产生的α、β、γ射线和各类x射线治疗机或加速器产生的x射线、电子线、中子束、质子束及其它粒子束等治疗恶性肿瘤的一种方法。通过放疗杀伤肿瘤细胞达到治愈或缓解肿瘤，延长生存期的目的。 辐射致癌和辐射治癌的分子机制涉及到很多基因功能的改变与发挥。辐射所致肿瘤的发生是一个非常复杂的过程，经历启动、促进、进展等几个阶段，一般认为，辐射造成细胞核DNA分子的严重损伤，使某些受照体细胞中特定的基因或染色体发生突变，其中涉及到原癌基因的激活和抑癌基因的失活或突变，双链断裂容易引起细胞内DNA错配损伤修复反应，造成基因组不稳定性，细胞增殖失控以及信号转导通路的改变等。近几年的研究表明辐射致癌过程中许多与肿瘤相关的基因出现结构改变和功能异常。放射治疗通过电离辐射作用于肿瘤细胞，导致肿瘤细胞发生凋亡和坏死。其杀伤作用的产生有赖于一系列基因功能的正常发挥。如：和诱导凋亡相关的Bcl-2，Caspase家族等。通过近十年的研究，发现在辐射生物学效应和诱导肿瘤细胞凋亡中，脆性组氨酸三联体基因(fragilehistidinetriad，FHIT)都发挥了重要作用，其功能的正常发挥对于保护正常细胞，诱导肿瘤细胞走向凋亡都起了重要作用。 FHIT基因是1996年Ohta等用差异显示分析探针和外显子捕获法在染色体3p14.2区域新发现的抑癌基因，全长约1Mb。其cDNA长1095bp，由10个外显子组成，其5'端含有一段长约350bp的非编码区，包含外显子1～3；外显子5～9组成一长约500bp的开放性阅读框架，编码一个由147个氨基酸组成的相对分子质量为16.8×103D的蛋白质。FHIT在生物机体内起广泛的作用，包括①调控细胞周期：将外源性FHIT基因导入FHIT纯合性缺失的肿瘤细胞后，细胞出现G0/G1期阻滞并伴有细胞周期蛋白的表达改变；②诱导细胞凋亡：利用流式细胞仪和TUNNEL法检测细胞凋亡，发现导入FHIT基因后，FHIT纯合缺失的肿瘤凋亡增加；③FHIT蛋白水解酶活性：腺苷酸三磷酸(Ap3A)是ATP类似物，其水平升高后，通过增强生长信号转导、阻断增殖抑制途径或凋亡通路导致肿瘤的产生。FHIT蛋白是二核苷多聚磷酸的水解酶，其水解Ap3A的催化活性最高；④促进微管组装：研究发现FHIT可能通过影响微管组装来发挥其抑制肿瘤作用，并且野生型和无水解酶活性的突变体无明显差别，促进微管组装的功能不依赖于其水解酶的活性。 本课题主要由3个部分组成： 1.为了更好地研究低剂量电离辐射对FHIT基因表达的影响和利用荷电微束研究单个细胞水平的基因改变。本课题改进了从单个细胞中扩增FHIT基因mRNA的策略，并对新建立的试验方法进行了优化。从单个细胞中利用一步法RT-PCR方法代替传统的两步法RT-PCR扩增目的基因，并且省去了细胞裂解和基因组DNA的消化，通过设计跨内含子的PCR引物，有效避免了基因组DNA造成的污染。利用半定量RT-PCR技术从细胞中扩增看家基因(β-actin)。结果表明新的一步法扩增较以前的两步法在忠实度方面没有差别，并且更灵敏，更省时、方便，简化了步骤，提供了扩增的成功率。根据扩增产物电泳条带密度定量分析表明从1个和3个细胞中扩增看家基因(β-actin)有显著性差异，可以进行半定量分析。新的单细胞RT-PCR方法完全可以胜任对特定基因表达的研究。 2.研究表明电离辐射可以导致FHIT基因失活，是FHIT基因失活的因素之一。Dano等研究发现，在吸入氡气所致的大鼠肺癌模型中频繁地发生FHIT基因缺失，其缺失的类型同人肺细胞癌和腺癌中发生的FHIT基因缺失类型相似，提示FHIT基因可能参与辐射致癌的过程。我室利用60Coγ射线照射BALB/c小鼠诱发白血病制成辐射致癌动物模型，在肿瘤组织和受照未癌变的正常组织中均检测出异常FHIT转录本和表达缺失。推断FHIT基因参与了辐射诱导的肿瘤形成过程，是辐射损伤的一个靶点。为了证实FHIT基因在辐射后早期和接受较低剂量电离辐射时的变化，本课题利用60Coγ射线放射治疗机照射BALB/c小鼠(分为0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy3个照射组和对照组)，在照射后36h和1周用乙醚麻醉小鼠，心脏抽血，再解剖取胸腺及骨髓细胞，采用巢式RT-PCR方法检测FHIT基因的表达异常转录本的情况。结果：对照组血液、胸腺及骨髓均未出现异常FHIT转录本的表达，不同剂量照射组中血液、胸腺及骨髓均有部分样品出现相对分子质量较小的异常FHIT转录本的表达。并且0.5Gy组一周相对于36小时检出率有明显下降。结论：电离辐射引起FHIT基因的缺失，在辐射后早期就可以出现，并可以在一定时间内稳定存在，支持其可能参与辐射损伤和辐射致癌的早期过程。 3.由辐射介导的肿瘤基因-放射治疗是近年来提出的新思路，其分子机制为小剂量电离辐射通过多条途径激活一些重要的分子靶点而导致肿瘤细胞凋亡。FHIT可以诱导细胞周期停滞和凋亡的特性使得其成为一个新的肿瘤基因治疗的靶点。并且近期研究表明FHIT基因纯合缺失的细胞接受电离辐射后细胞S期和G2期DNA损伤checkpoint反应增强，发生凋亡逃逸，在正常细胞中造成基因组不稳定和恶性转化，在肿瘤细胞中造成肿瘤细胞发生凋亡逃逸，存活增殖。并且FHIT蛋白功能的发挥和导致G2期停滞的ATR/CHK1通路激活有关。本课题根据FHIT基因的功能，构建含有FHIT基因编码序列的真核表达质粒pcDNA-FHIT，用lipofectamine2000脂质体转染pcDNA-FHIT、pcDNA3.0质粒进入人肝癌细胞株HepG-2，通过G-418筛选得到整合质粒的细胞株pcDNA-FHIT-HepG和pcDNA-HepG。通过qRT-PCR和WesternBlotting鉴定得到的细胞株。进一步利用CCK-8研究细胞的增殖，接受γ射线辐射后存活曲线。利用PI(碘化吡啶)单染通过流式细胞仪检测细胞周期，用Hoechst33258染色和AnnexinV/PI双染检测凋亡。研究在细胞水平FHIT和γ射线有无协同杀伤肿瘤作用和FHIT联合放射治疗治疗肿瘤的可行性。 结论： 1.建立的单细胞RT-PCR可以快速、高效扩增出目的基因； 2.电离辐射可以导致FHIT基因的损伤，并且在受照后早期就存在，支持FHIT基因的失活参与了辐射致癌早期过程的推论； 3.FHIT基因转染可以增加肿瘤细胞的辐射敏感性，和电离辐射具有较好的协同杀伤肿瘤的作用。FHIT基因可以作为一个较好的肿瘤基因治疗的靶点。

目录

论文说明：缩略词

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前 言

第一部分 一步法单细胞逆转录PCR的建立和优化

第二部分：BALB/c小鼠г辐射后早期FHIT基因的变化

第三部分:FHIT基因转染HepG-2对放射敏感生影响的研究

全文总结

参考文献

脆性组氨酸三联体基因研究进展

辐射诱导旁效应研究进展

A quick simple method to amplify specifice mRNA segments from single cells Abstract

文章发表情况

致 谢