人骨形态发生蛋白-7基因强化的组织工程骨的构建及对兔骨缺损修复作用研究

摘要

目的：创伤、感染、肿瘤、先天性疾病等原因所致的骨缺损临床常见。组织工程骨兼有骨诱导性和骨传导性，且可根据需要制成不同的形状，为临床治疗大段骨缺损带来希望。但是组织工程研究中，细胞因子无论是从天然生物中提纯，还是用基因工程表达，均存在程序复杂，产量低，活性不稳定等缺点，因此如何有效发挥细胞生长因子适时、适量效用，利用细胞与基质材料特异性黏附，细胞增殖，定向分化，发挥正常的生理功能，以实现最终理想的功能替代，一直是组织工程研究的难点与热点，基因工程技术与组织工程的结合为以上问题的解决提供了可供选择的良好办法。 目前BMP-7重组蛋白及医用硫酸钙已商品化。本实验以医用硫酸钙为支架材料，转染人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)基因的骨髓基质细胞(BMSCs)作为种子细胞，体外构建基因强化的组织工程骨，并研究该组织工程骨对骨缺损的治疗作用。希望能为骨缺损的治疗提供实验和理论依据。 方法： 1.BMP-7基因重组腺病毒载体(Ad.BMP-7)的构建抽提人胎肾组织总mRNA，经RT-PCR合成rBMP-7基因，继而再将其插入带有腺病毒基因组的、扩增后挑选插入方向正确的克隆。在脂质体介导下，用携带目的基因的粘粒载体pAxcAwt.BMP-7与腺病毒基因组末端蛋白DNA-TPC共同转染293细胞，制备重组腺病毒。通过对重组腺病毒DNA进行PCR检测及酶切鉴定，将鉴定好的病毒克隆进一步扩增、纯化和测定滴度。 2.髓基质细胞体外的分离、培养以及Ad.BMP-7体外转染骨髓基质细胞后的表达采用密度梯度离心法与贴壁筛选法联合体外分离、培养兔骨髓基质细胞(BMSCs)，观察原代及传代细胞的生长发育情况，并绘制生长曲线。Ad.BMP-7转染BMSCs，使用荧光显微镜和免疫组化方法检测BMP-7蛋白在细胞中的表达。 3.体外构建BMP-7基因强化的组织工程骨将第三代骨髓基质细胞和转染BMP-7基因的骨髓基质细胞分别与硫酸钙材料在体外复合培养，通过消化法、倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在材料上的黏附情况，绘制细胞生长曲线。 4.基因强化的组织工程骨对骨缺损修复的动物实验60只新西兰大白兔随机分为A、B和C三组，每组20例。A组在骨缺损处植入BMP-7基因+BMSCs+医用硫酸钙材料，B组在骨缺损处植入BMSCs+医用硫酸钙材料，C组单纯植入医用硫酸钙。分别在术后4、8和12周取材，通过大体观察、影像学、组织学和生物力学等方法观察实验动物骨缺损的修复情况。 结果： 1.提取的RNA完整，纯度高。RT-PCR合成的DNA片段经克隆、测序后确证为目的基因(BMP-7基因)，插入粘粒载体pAxCAwt后获得高滴度重组腺病毒(108pfu/ml)。 2.培养获得了高纯度的兔骨髓基质细胞(BMSCs)。骨髓基质细胞转染Ad.aBMP-7后72小时荧光显微镜可见绿色荧光蛋白表达，细胞免疫组化结果显示细胞内有BMP-7蛋白的表达。 3.骨髓基质细胞及转染BMP-7基因的骨髓基质细胞在硫酸钙表面均有生长，且随着复合培养时间的延长，材料上细胞的数量也随之增长。 4.影像学、病理学及生物力学检测结果：BMP-7基因修饰的组织工程骨在植入动物骨缺损区后，能更快地修复骨缺损。 结论： 1.DNA末端蛋白复合物可使重组腺病毒的制备效率大大提高，降低野生型腺病毒出现的概率。重组腺病毒滴度高、纯度好、毒性低。 2.我们构建的携带BMP-7基因的腺病毒载体，能高效转染培养的骨髓基质细胞。后者能够表达、分泌BMP-7蛋白。 3.成功构建BMP-7基因强化的组织工程骨。 4.BMP-7基因强化的组织工程骨能更快地修复兔骨缺损。分析可能机制是：转染BMP-7的骨髓基质干细胞通过自分泌和旁分泌的途径产生BMP-7蛋白，可使BMSc分泌骨特异性细胞外基质的能力增强，由于BMP-7本身有很强的成骨能力，因此在BMSc作为组织工程骨种子细胞参与成骨的同时，合成和分泌的BMP-7进一步促进了新生骨组织的形成，提高了骨缺损的修复效果。

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文摘

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前言

第一部分人骨形态发生蛋白-7成熟肽基因重组腺病毒的制备

第二部分兔骨髓基质细胞体外分离、培养及Ad.BMP-7/GFP转染细胞的表达

实验三 体外构建BMP-7基因强化的组织工程骨

第四部分BMP-7修饰的组织工程骨对兔桡骨缺损的修复作用

全文总结

骨缺损的局部基因治疗

在读期间撰写及发表论文情况

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