短瓣金莲花黄酮类成分制备工艺、质量标准及抗氧化活性研究

摘要

短瓣金莲花(TrolliusledebouriReichb.)为毛莨科金莲花属(TrolliusL.)植物的干燥花，属系野生的多年生草本植物，主要分布于黑龙江及内蒙古东北部等地区。近代研究表明，其具有抑菌、抗病毒、抗氧化等功效，其效用同于金莲花(TrolliuschinensisBge.)。目前普遍认为黄酮类化合物是金莲花属植物的主要有效成分，生药鉴别和药品质量评价也均以黄酮为指标。为了综合开发利用药用植物资源，寻找金莲花的新药用资源，本课题对短瓣金莲花的黄酮有效部位进行了系列研究：从中分离制备了四种高纯度黄酮苷单体，并考察了不同产地短瓣金莲花药材中四种黄酮苷的含量。同时，考察了不同产地药材中总黄酮提取物及其单体的抗氧化活性。对短瓣金莲花总黄酮有效部位的提取纯化工艺及质量标准进行了系统研究。 1.短瓣金莲花中黄酮苷单体的制备利用高速逆流色谱制备黄酮单体：溶剂体系及用量体积比为乙酸乙酯：正丁醇：水=2∶1∶3，分取上下相，上相为固定相，下相为流动相。转速800rpm，进样190min后，将流动相流速调为2.5ml/min。水浴温度：25℃。检测波长为254nm，根据检测器谱图接收目标成分。高速逆流色谱分离所得不纯流份经反相制备液相色谱进一步纯化。最终得到槲皮素-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素-3-O-巢菜糖苷、荭草苷及牡荆苷四种黄酮苷类单体。 2.不同产地短瓣金莲花药材中黄酮苷的含量测定建立了高效液相色谱同时测定短瓣金莲花中主要单体指标成分(槲皮素-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素-3-O-巢菜糖苷、荭草苷及牡荆苷)的含量分析方法。同时，考察了不同产地短瓣金莲花药材中四种黄酮苷的含量。结果表明产地不同，其四种黄酮苷含量也均有差异。但各产地药材中荭草苷及槲皮素-3-O-新橙皮糖苷的含量者含量之和却基本相同(1.477～1.673％，仅济南产为1.272％)。并且各产地药材中所测四种黄酮苷所占含量也基本接近(1.854％～2.096％，济南产为1.642％)。此结果对短瓣金莲花药用资源开发具一定提示作用。 3.短瓣金莲花总黄酮及其黄酮苷单体体外抗氧化活性研究以VitC为阳性对照药物，系统研究了不同产地短瓣金莲花的黄酮提取物及其四种黄酮苷单体的体外抗氧化活性。结果表明短瓣金莲花中黄酮苷单体有较强的体外抗氧化活性作用：对DPPH自由基有较强的清除作用(IC50：4.03～4.74ug/ml)，具有较强的抑制大鼠红细胞氧化性溶血的作用(IC50：12.27～18.10ug/ml)，能明显清除.OH(IC50：6.08～7.68ug/ml)及O2-(IC50：5.02～6.06ug/ml)。结果还显示不同产地的短瓣金莲花总黄酮提取物也具有较强的抗氧化活性且活性基本接近。结合第二章对不同产地药材黄酮苷含量考察结果，我们发现各产地药材总黄酮提取物的抗氧化活性与该药材中单一黄酮苷含量无明显量效关系，而与总黄酮含量有关。 4.短瓣金莲花总黄酮提取纯化工艺研究研究了从短瓣金莲花药材中提取、纯化总黄酮部位的方法，特别是系统研究了大孔吸附树脂对金莲花总黄酮的吸附纯化特性及应用。 提取工艺研究：实验采用L9(34)正交实验设计，考察提取溶剂、提取时间及提取溶剂用量对总黄酮提取率的影响。结果表明提取溶剂对总黄酮提取率影响最大，提取时间对提取率的影响较小。由此得出的最佳提取工艺条件为：60％乙醇为提取溶剂，乙醇用量为药材12倍，每次回流提取1.5h。 总黄酮的纯化工艺研究：通过对短瓣金莲花总黄酮在几种大孔吸附树脂上的吸附与解吸特性的比较，筛选分离总黄酮有效部位的最佳树脂，并对该树脂的吸附特性及各影响因素进行系统研究，在此基础上用正交实验法及单因素分析法对金莲花总黄酮在树脂上的纯化工艺条件进行优选，得到总黄酮有效部位最佳的纯化工艺条件。结果：以D101大孔吸附树脂为分离载体，样品液浓度为0.5g/ml，pH6.0，上样量为药材(g)：树脂(g)=1∶1，上样后静态吸附1h，先用4BV水洗脱除杂，再用6BV30％乙醇解吸，取解吸液浓缩并真空干燥得固形物，即为短瓣金莲花总黄酮，总黄酮平均含量为60％以上。 5.短瓣金莲花总黄酮提取物质量标准研究进行了短瓣金莲花总黄酮有效部位的质量研究。采用颜色反应、薄层色谱法及高效液相色谱法进行鉴别，紫外分光光度法测定总黄酮含量，建立了高效液相色谱同时测定短瓣金莲花总黄酮有效部位中主要单体指标成分(槲皮素-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素-3-O-巢菜糖苷、荭草苷及牡荆苷)的含量分析方法。 Studyonextractionandpurificationprocess,qualitystandardandantioxidativeactivitiesoftotalflavonoidsfromTrolliusledebouriReichb.

目录

文摘

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摘要

前言

第一章：短瓣金莲花中黄酮苷单体的制备

第二章：不同产地短瓣金莲花药材中黄酮苷含量测定

第三章：短瓣金莲花总黄酮及其黄酮苷单体体外抗氧化活性研究

第四章：短瓣金莲花总黄酮提取纯化工艺研究

第五章：短瓣金莲花总黄酮提取物质量标准研究

小结

参考文献

致谢

论文发表情况

金莲花黄酮类化合物的研究进展