可诱导共刺激分子通路在同种异体移植免疫中的作用及其机理研究

摘要

本研究共分五个部分：第一部分构建了ICOS-Ig融合蛋白真核表达体系，表达及纯化ICOS-Ig融合蛋白。第二部分对ICOS-Ig融合蛋白的各项理化性质进行了鉴定。第三部分确证ICOS：ICOSL共刺激通路对T细胞免疫功能的正向调节作用，通过体内外实验证实ICOS-Ig竞争性阻断ICOS：ICOSL共刺激通路抑制同种异体T细胞增殖，并可诱导供体特异性T细胞低反应性，即供体特异性免疫耐受。第四部分探讨了ICOSL：ICOS共刺激通路对DC免疫功能可能存在的反向调节作用，ICOS-Ig与DC表达的ICOSL结合，可抑制DC成熟，减弱对同种T细胞的刺激能力，并抑制MAPK信号转导通路的活化。第五部分通过建立小鼠血管化的同种异体心脏移植模型，体内证实ICOS-Ig可明显抑制免疫排斥反应，延长移植物的存活时间，联合CsA可发挥协同作用，进一步实现移植物的长期存活。 第一部分可诱导共刺激分子(ICOS)-Ig融合蛋白真核表达体系的建立为对该共刺激分子进行更深入的研究，我们构建了人ICOS胞外区和人IgG1Fc段重组真核表达质粒，并在CHO细胞中实现了ICOS-Ig融合蛋白的稳定分泌性表达。首先RT-PCR从活化的人外周血单个核细胞总RNA中克隆ICOS胞外区片段，并从表达载体pIGplus中扩增人IgG1重链基因Fc恒定区，然后克隆入真核表达载体pSecTag2，获得重组质粒pSecTag2-ICOSIg。重组质粒pSecTagA-ICOSIg脂质体转染CHO细胞，HycromycinB加压筛选，建立稳定表达ICOS-Ig的CHO细胞库。用HumanIgGELISA试剂盒检测各细胞克隆的表达量，筛选表达量大于10pg/cell·24hr的细胞克隆进行保留；再进行稳定性实验，最终保留5个连续三次检测结果均大于20pg/cell·24hr的克隆，用于大规模转瓶扩增。高表达细胞克隆进行大规模转瓶细胞培养，细胞扩增期用含10％FCS的DMEM培养，并保持HygromycinB筛选压力，待细胞长满转瓶后，换SFM无血清培养液培养5-7天，收集上清液。先利用ProteinA与目的蛋白IgG1Fc段特异性结合的性质，采用rProteinA-SepharoseFF亲和层析，快速获取目的蛋白粗品。再用DEAE阴离子层析和Superdex200PG分子筛层析逐级纯化，最终获得纯化的ICOS-Ig融合蛋白样品。 第二部分可诱导共刺激分子(ICOS)-Ig融合蛋白各项理化性质的检定无论是进行实验研究还是临床治疗，我们都需要全面深入了解可诱导共刺激分子(ICOS)-Ig融合蛋白的各项理化性质。 第三部分可诱导共刺激分子(ICOS)-Ig对T细胞免疫功能的正向调节作用本部分实验体内外研究ICOS-Ig竞争性阻断ICOS：ICOSL共刺激通路对同种异体T细胞免疫功能的抑制作用，确证ICOS：ICOSL共刺激通路对T细胞免疫功能的正向调节作用，为下一步体内诱导同种移植抗原的免疫耐受提供实验依据。 第四部分可诱导共刺激分子(ICOS)-Ig对树突状细胞免疫功能的反向调节作用ICOS：ICOSL作为CD28：B7家族的一员，其研究热点目前集中在对表达ICOS的T细胞功能的影响上，有关ICOSL：ICOS反向信号对表达配体ICOSL的APC细胞功能的影响尚未见任何报道。 本部分实验以自行制备的ICOS-Ig模拟T细胞的ICOS与DC细胞表达的ICOSL结合，观察ICOSL：ICOS反向信号对DC细胞凋亡、免疫表型和分泌细胞因子的影响；观察ICOS作用的DC吞噬能力、抗原提呈能力的改变及对BALB/c小鼠的T细胞刺激能力的变化；探讨该变化可能的信号转导通路。我们采用GM-CSF、IL-4体外扩增C57BL/6小鼠骨髓来源的DC，培养过程中加入ICOS-Ig，设正常DC及IgG处理DC为对照。培养6天的未成熟DC，加入脂多糖(LPS)继续培养24小时，诱导为成熟DC。结果发现：ICOS-Ig处理不会引起DC明显凋亡。DC细胞表面CD40、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、Iab(MHCⅡ)的表达水平随LPS诱导成熟而明显上调，而ICOSL的表达随成熟明显下调。ICOS-Ig处理组DC细胞CD40、CD80、CD86、Iab的表达水平低于对照组，并对LPS诱导的上述分子的表达水平上调有一定抑制作用，说明ICOS-Ig可能抑制DC成熟。ICOS-Ig处理可增强DC分泌IL-10的能力，并对LPS引起的IL-12分泌增加有一定抑制作用。用HTC标记的卵白蛋白(OVA)作为抗原，ICOS-Ig处理的DC摄取FITC-OVA的能力高于对照组，说明ICOS-Ig可增强DC的吞噬能力。用吞噬OVA的DC刺激经OVA免疫的C57BL/6小鼠脾细胞，用同基因脾细胞的增殖来反映DC的抗原提呈功能，结果显示，ICOS-Ig处理的DC对OVA免疫的同基因淋巴细胞的增殖能力明显低于对照组，说明ICOS-Ig抑制DC的抗原提呈功能。DC与BALB/c鼠脾T细胞的混合淋巴细胞培养实验表明，ICOS-Ig作用的DC激活同种T细胞增殖的能力明显弱于对照组，说明ICOS-Ig作用的DC对同种T细胞刺激能力减弱。我们的实验从免疫表型、细胞因子分泌、吞噬能力和抗原提呈功能等方面证明，ICOS-Ig抑制了DC的成熟，并减弱了对同种T细胞的刺激能力。MAPK信号转导通路在DC的分化、成熟中发挥重要作用，ICOS-Ig作用的DC细胞ERK、JNK和p38MAPK磷酸化水平降低，说明ICOS-Ig的作用可能部分通过调节MAPK信号途径来实现。 第五部分可诱导共刺激分子(ICOS)-Ig在小鼠异体心脏移植免疫中作用的实验研究为进一步说明ICOS-Ig体内环境下能否诱导供体特异性免疫耐受，本部分研究采用同种小鼠心脏移植模型，研究ICOS-Ig联合亚剂量免疫抑制剂CsA体内诱导同种特异性心脏移植物的免疫耐受效果，并分析其相关的免疫学机理。 将体重20-22克、周龄相同的C57BL/6鼠(H-2b)随机分组作为受者，分别接受BALB/c鼠(H-2d)供心的移植，术后处理如下：不做处理组；IgG组(250μgi.p.d2、4、6)；ICOS-Ig组(250μgi.p.d2、4、6)；CsA组(10mg/kgi.p.d0-6)；另一组联合应用ICOS-Ig和CsA。结果发现：术后腹腔免疫ICOS-Ig组移植心脏存活期为29.5±7.7天，较未处理组及IgG组9±2天和8.5±1天显著延长(P＜0.05)；ICOS-Ig和CsA联合应用组，效果要明显优于二者单独使用，可使异体移植心脏长期存活(＞100d，P＜0.01)。对移植物组织病理检查发现，不做处理及IgG免疫等对照组表现为心肌明显变性纤维断裂，间质水肿，肌束间及血管周围有大量的炎性细胞浸润，而ICOS-Ig和/或CsA免疫组表现为心肌无明显变性，间质略水肿，血管周围有少量的淋巴细胞浸润，其中联合应用组效果要明显优于二者单独使用。体内机理发现：ICOS-Ig和/或CsA免疫后，脾脏T细胞的MLR活性及CTL活性明显降低；受鼠血清中供体特异性同种抗体IgG水平较对照组降低，表明ICOS-Ig对受体细胞免疫和体液免疫均有一定程度的抑制作用，且与CsA发挥协同作用。 结论：本课题成功构建了ICOS-Ig融合蛋白真核表达体系，表达及纯化ICOS-Ig融合蛋白，并对蛋白的各项理化性质和生物学活性进行了鉴定。然后以自行制备的ICOS-Ig为工具，研究ICOS：ICOSL共刺激通路是否具有双向免疫调节作用，及其在移植免疫中的作用和机理。首先确证ICOS：ICOSL对T细胞免疫功能的正向调节作用，通过体内外实验证实ICOS-Ig竞争性阻断ICOS：ICOSL抑制同种异体T细胞增殖，并可诱导供体特异性T细胞低反应性，即供体特异性免疫耐受；然后以ICOS-Ig模拟T细胞的ICOS与DC表达的ICOSL结合，从免疫表型、细胞因子分泌、吞噬能力和抗原提呈能力等各方面反映ICOS-Ig抑制DC成熟，并减弱了对同种T细胞的刺激能力，提示ICOSL：ICOS对DC细胞免疫功能存在反向调节作用；最后通过建立小鼠血管化的同种异体心脏移植模型，体内证实ICOS-Ig可明显抑制免疫排斥反应，延长移植物的存活时间，联合亚剂量免疫抑制剂CsA可发挥协同作用，进一步实现移植物的长期存活。这将丰富ICOS：ICOSL共刺激通路免疫调控的理论知识，并为将来ICOS-Ig在临床器官移植中的可能应用提供了实验依据。

目录

文摘

英文文摘

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缩写词表

前 言

第一部分 可诱导共刺激分子（ICOS）-Ig融合蛋白真核表达体系的建立

第二部分可诱导共刺激分子（ICOS）-Ig融合蛋白各项理化性质的检测*

第三部分 可诱导共刺激分子（ICOS）-Ig对T细胞免疫功能的正向调节作用

第四部分 可诱导共刺激分子（ICOS）-Ig对树突状细胞免疫功能的反向调节作用

第五部分 可诱导共刺激分子（ICOS）-Ig在小鼠异体心脏移植免疫中作用的实验研究

小 结

ICOS：ICOSL共刺激通路研究进展

致 谢