人组织激肽释放酶5抗体制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

摘要

目的：人组织激肽释放酶基因家族(Kallikreins，KLKs)是一种新型肿瘤标志物家族，包括15个成员(KLK1-KLK15)。人组织激肽释放酶基因5(Kallikrein5，KLK5)是该家族成员之一，既往研究证实KLK5在激素相关肿瘤中异常表达且与肿瘤的形成、发展、转移有高度相关性。本课题以人组织激肽释放酶5(human Kallikein5，hK5)重组蛋白为抗原制备兔抗hK5多克隆抗体和鼠抗hK5单克隆抗体，并建立双抗体夹心酶联免疫检测(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法；通过对多种肿瘤血清和健康体检血清标本的检测，对其临床应用价值进行初步评价。
　　 方法：⑴通过表达条件的优化使hK5重组蛋白高效表达，并通过Ni-NTA柱纯化出重组hK5蛋白；经SDS-PAGE分离检测目的蛋白的纯度和分子量；Western blot方法检测目的蛋白的特异性和BCA方法测定蛋白浓度。⑵以目的蛋白为抗原对新西兰大白兔进行皮下多点免疫，末次免疫一周后，应用间接ELISA方法检测抗体效价；对新西兰大白兔进行心脏采血并分离血清，-80℃保存备用；以重组蛋白免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术诱生含单克隆抗体的腹腔积液并收集。用ProteinA纯化试剂盒纯化抗血清及腹腔积液，所得抗体进行免疫组化(immunohistochemistry，IHC)和Western blot检测。⑶以单克隆抗体为捕获抗体，辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体为检测抗体；采用棋盘滴定法确定最佳工作浓度，建立双抗体夹心ELISA检测方法；通过对临床血清标本的检测对检测方法进行初步评价。
　　 结果：①通过对诱导条件的优化，最终确定在28℃条件下，IPTG终浓度为1mM诱导8h时目的蛋白的表达量达到峰值，重组蛋白是以可溶性形式存在细菌裂解液中。目的蛋白分子量约为28kD。Western blot结果显示重组蛋白可以与anti-his抗体特异性的结合。②分离免疫兔血清，间接ELISA方法检测血清效价约达1:106；Western blot结果证实了所得多克隆抗体可以特异性的与目的蛋白结合，具有较高的特异性；IHC结果分析表明：hK5定位于细胞浆内，在卵巢癌、胃癌组织细胞中均有表达。利用杂交瘤技术筛选出4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2B4，2D4，3B6，3F8；通过动物体内诱生方法制备了含大量单克隆抗体的腹腔积液，间接ELISA方法检测腹水效价达1:105，通过纯化得到高纯度的单克隆抗体。Western blot和IHC结果证实单克隆抗体有高度特异性。③双抗体夹心ELISA方法的最佳工作条件为：包被抗体浓度为7.5μg/mL，酶标抗体最佳稀释比例为1:1000(1μg/mL)，该方法的检测范围为0.45-125ng/mL，检测下限为0.2ng/mL。对临床血清标本的检测结果显示：hK5在卵巢癌血清中含量为(3.77±1.47)ng/mL，显著高于健康女性血清(0.86±0.45)ng/mL(P<0.01)，40例卵巢癌患者血清其中有27例(67.5％)hK5含量升高(>1.76ng/mL)；在结直肠癌血清中含量为(0.50±0.18)ng/mL，显著低于正常血清(0.72±0.41)ng/mL(P<0.05)。
　　 结论：⑴制备了高效价、高特异性的兔抗hK5多克隆抗体和鼠抗hK5单克隆抗体。⑵构建了双抗体夹心ELISA检测方法，可定量分析血清中hK5含量。⑶hK5在大部分卵巢癌患者血清中含量显著高于健康女性血清，而在大部分结直肠癌患者血清中表达量较正常血清下降。