牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的单克隆抗体制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

摘要

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由牛疱疹病毒Ⅰ型(bovineherpesvirus-1，BHV-1)引起的一种急热性、接触性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为B类疾病，是我国进境动物和国际动物贸易重点检疫的对象。本病主要感染牛，肉用牛较为多见，奶牛次之。感染BHV-1的牛会终生带毒。ELISA是一种用于BHV-1检测的灵敏快速的方法，可以及时发现患畜体内的病毒，防止BHV-1在牛群中大量传播，从而使经济损失降到最低。
　　本病毒属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，水痘病毒属。BHV-1基因组为双股线性DNA，长约137 Kb，周围为一层含脂质的囊膜，预计含有约70个编码基因。gB基因长约2940 bp，该蛋白高度保守，是病毒感染所必需的，也是刺激宿主免疫应答的主要抗原蛋白之一。本课题选择了编码BHV-1 gB囊膜蛋白的gB基因在大肠杆菌中进行原核表达，并制备了抗BHV-1的单克隆抗体，为IBRV ELISA诊断方法的建立奠定了基础。
　　研究一:BHV-1 gB基因的原核表达。根据BHV-1 Colorado1全基因序列，用DNAstar序列分析软件分析gB编码产物的疏水性和抗原表位。设计了一对针对gB基因的特异性引物，利用PCR技术扩增gB基因片段，大小为585 bp。并基于后续重组蛋白纯化的考虑，将gB基因片段克隆入带有组氨酸标签的原核表达载体pET-22b(+)中，筛选并鉴定重组质粒，将重组质粒pET-22b-gB转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)进行诱导表达，获得包涵体形式的融合蛋白，大小约为26 KDa。将菌体超声裂解后，利用尿素变性复性融合蛋白，然后用Protino Ni-TED2000 packed columns试剂盒纯化该蛋白，经免疫印迹分析该融合蛋白能被鼠抗BHV-1阳性血清特异性识别，说明体外表达的融合蛋白有较好的反应原性。
　　研究二:抗BHV-1 gB基因单克隆抗体的制备及初步应用。在MDBK细胞上增殖BHV-1，用PEG6000浓缩之后，再用20％蔗糖垫底离心纯化病毒，最后透析得到的BHV-1病毒液作为制备单克隆抗体的免疫原。经间接ELISA方法（以纯化的病毒液和pET-22b-gB蛋白为捕获抗原）最终获得3株能稳定分泌抗BHV-1 gB基因单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2G4、2G6、3E9，3株单抗腹水的ELISA效价分别为128000、128000、64000。免疫印迹和间接免疫荧光结果表明本研究制备的单抗能与纯化的牛疱疹病毒发生特异性反应，而与牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感3型病毒(BPIV-3)无交叉反应。以捕获ELISA的方法对3株单抗进行亚类鉴定，结果显示2G4、2G6、3E9均为IgM抗体。利用单克隆抗体的高特异性及双抗体夹心ELISA方法的灵敏性，建立检测BHV-1的双抗体夹心ELISA方法，以抗体效价为128000的单克隆抗体2G4为捕获抗体，以兔源抗BHV-1 gB的多克隆抗体为第二抗体，方阵检测确定捕获抗体的最佳浓度为4μg/mL，兔源抗BHV-1 gB的多抗的最佳工作浓度为65 ng/mL，BHV-1最低检出量为80 ng/mL。用建立的双抗体夹心ELISA法检测20份疑似有BHV-1感染的牛鼻腔分泌物的细胞培养样品，8份为阳性，和PCR扩增结果符合率为90.0％，说明了建立的双抗体夹心ELISA方法可用于BHV-1感染的临床诊断。