细胞毒抗肿瘤药物的共同基因表达谱的研究

摘要

基因表达谱芯片技术是近年来发展起来的一项前沿生物技术，可以对成千上万种基因的表达水平进行平行、快速、准确、高效的检测。基因芯片技术对于药物作用分子机制研究、药物靶标的发现、多靶点高通量药物筛选、药物活性及毒性评价等领域具有无可比拟的优势。 细胞毒抗肿瘤药物与不同的靶点结合后发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的作用。虽然目前已有大量的文献报道有关细胞增殖和凋亡的调控分子和反应通路，但是这些药物作用靶点与细胞内其它的调控分子或反应通路尚不完全清楚。由于不同的细胞毒抗肿瘤药物所致的细胞表型变化相似，因此可以推测：不同的抗肿瘤药物可能共享某些细胞内信号传导通路，而这些细胞内传导通路中的分子则可能与调控肿瘤细胞增殖和凋亡有关。因此，寻找新的细胞增殖和凋亡的调控分子和反应通路对于进一步了解药物的作用机制和发现新的药物靶点具有重要的意义。 本研究基于上述的设想，选择了喜树碱、紫杉醇、高三尖杉酯碱和放线菌素D作用于白血病HL-60细胞和肝癌QGY7703细胞，利用基因芯片技术研究药物反应的基因表达谱，并应用Genmapp分析软件和Access软件，对药物反应基因进行聚类分析和药物反应通路分析。并应用实时定量PCR对一些重要基因进行确证。结果如下： 1.为研究抗肿瘤药物早期敏感反应基因表达谱，我们首先研究4个细胞毒抗肿瘤药物对白血病HL-60和肝癌QGY7703细胞表型的影响。采用噻唑蓝(MTT)法检测紫杉醇、高三尖杉酯碱、喜树碱、放线菌素D作用于HL-60细胞和QGY-7703肝癌细胞24h的药物半数抑制浓度(IC50)分别为0.025、320、79.85、2.67、μmol/mL和2.26、52.77、19.09、0.48、μmol/mL；实验同时采用形态学观察和流式细胞仪检测细胞凋亡以及细胞周期，实验表明，两种肿瘤细胞与各药物孵育1h，细胞形态未见变化，作用24h可见细胞破碎、数目减少；流式细胞仪检测结果显示，紫杉醇和高三尖杉酯碱作用24h可加速白血病细胞和肝癌细胞通过G1/S期，导致G2/M期阻和细胞凋亡。 2.HL-60细胞和QGY-7703肝癌细胞分别用上述药物的IC50处理1h后，实验同时设加药物溶剂的对照组。抽提细胞RNA，然后用荧光试剂制备cDNA探针，再与14400型基因表达谱芯片杂交，用ScanArray 3000扫描芯片和ImaGene 软件分析荧光信号的强度和比值。选择三次实验杂交比值的平均值自然对数绝对值≥0.69作为判定基因表达差异标准，筛选出各药物作用的早期反应基因。结果显示，4个抗肿瘤药物均诱发强烈的细胞基因表达改变，其中紫杉醇和高三尖杉酯碱诱导HL-60和QGY7703细胞的反应基因最多。 3．应用Genmapp分析软件对药物反应基因进行聚类分析和药物反应通路分析，发现4个抗肿瘤药物可调控细胞内许多反应通路、功能基因或细胞组分。例如，紫杉醇可调控mRNA加工过程；高三尖杉酯碱可抑制蛋白酶体组分26S亚单位PSMC3、PSMD2和PSMD11表达；喜树碱影响G蛋白信号通路中多条基因的表达；放线菌素D可调节丝裂素活化的蛋白激酶(MAPK)通路、TNF-NFkB通路等，这些结果说明药物起始靶点与许多已知的调控细胞增殖和凋亡的通路相连，而这些通路可以很好地解释药物的作用。此外，细胞毒抗肿瘤药物还调节了一群组织特异的基因，如喜树碱影响一些内脏器官、内分泌系统和中枢神经系统的基因，放线菌素D也能调节一些正常胚胎干细胞基因表达，提示这些基因的改变可能与其毒性有关。 4．应用microsoft office Access软件对药物反应基因和药物反应通路进行统计分析，发现细胞毒抗肿瘤药物之间在转录水平上可共享某些同向改变的基因或反应通路，其中2个药物之间最多，共用反应基因和通路在3个药物之间，甚至全部4个药物都可见到，例如全部4个药物在HL-60和QGY7703细胞中分别有17条乘140条共用反应基因以及7条和9条反应通路。在2个细胞系中，4个抗肿瘤药物也有6条的共同反应基因，它们是GRN、MLL3、PSAP、ERP29、LRPAP1、ST3GAL4，也共享肌动蛋白—细胞骨架调节通路和粘着斑功能调节通路。这些结果提示拓朴酶抑制、微管、核糖体和DNA模板干扰在转录水平上具有共同的下游作用，通过这些下游通路或分子可能最终导致相似的表型变化。 5．共用反应基因在功能上可分为：生长增殖相关基因、凋亡相关基因、糖代谢相关基因及其它功能基因4类，这些共用基因所编码的蛋白生物功能多样，分别参与了细胞周期调节，DNA、RNA和蛋白质合成，能量代谢，泛素(类泛素)蛋白酶体依赖的蛋白质降解，信号传导通路、抗凋亡或促凋亡等重要的细胞生命活动以及内质网以及线粒体等构成。 (1) 抗肿瘤药物能显著抑制细胞表达细胞周期相关基因，如蛋白磷酸酶2A、翻译延长因子1、HnRNPB1等，这些基因参与了细胞有丝分裂、核酸合成、DNA复制和修复以及RNA加工和蛋白质合成：此外，还能抑制具有促增殖作用的肿瘤相关蛋白基因(如GRN、MLL3)的表达，表明抗肿瘤药物可通过调节细胞增殖基因的表达，来抑制肿瘤细胞的生长甚至导致死亡； (2) 抗肿瘤药物能诱导细胞表达促凋亡基因PMAIP1以及抑制抗凋亡基因PSAP的表达，说明调节凋亡相关基因的表达也是抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的一个重要机制； (3) 抗肿瘤药物能调节内质网以及线粒体构成诱导细胞凋亡，如ERP29是内质网腔膜蛋白，作为氧化还原酶和分子伴侣，参与蛋白质折叠和运输。ARF5是囊泡转运包被复合体形成所必需，参与了内质网和高尔基体间的蛋白转运。抗肿瘤药物抑制两者表达，可能阻断蛋白在内质网与高尔基体的转运，从而诱导内质网应激而使细胞凋亡。mitochondrial ribosomal protein S18A 是线粒体核糖体组分，衰老细胞线粒体核糖体蛋白合成的准确性下降。isocitrate dehydrogenase 2参与三羧酸循环，SLC25A6 为ADP/ATP转运子，因此，抑制参与能量代谢的基因表达可能会引起线粒体呼吸链功能缺陷或者ATP耗竭而导致细胞死亡。 (4)抗肿瘤药物能抑制泛素(类泛素)蛋白体蛋白降解系统相关基因PSMC3、VCP 和SAE1表达。PSMC3是蛋白酶体26S蛋白酶体19S调节亚基的核心组分，VCP/p97是一种AAA ATP酶，在辅助因子协助下，可使错误折叠的蛋白从内质网膜脱位进入胞浆，经泛素蛋白酶体系统降解。SAE1/SAE2是小泛素相关修饰剂(SUMO-1)活化酶，参与类泛素途径调节，由于蛋白酶体参与细胞周期、增殖和凋亡调节，因此抑制泛素蛋白酶体途径可能也是抗肿瘤药物的一个重要机制。 (5) 抗肿瘤药物能抑制唾液酸转移酶4C和糖苷转运子SLC35D1表达，而这二者均在多种肿瘤中表达增加，参与肿瘤的转移。因此，抑制蛋白糖基化可能与药物的抗转移作用有关。文献检索发现，有些共用基因已作为抗肿瘤药物筛选靶点，例如，蛋白酶体抑制剂是一种新型的抗肿瘤药物，已进入临床实验；基于蛋白磷酸酶PP2A分子模建，目前已设计了系列蛋白磷酸酶抑制剂，体内外结果显示蛋白磷酸酶抑制剂具有广谱的抗肿瘤效果。此外，唾液酸转移酶抑制剂也能显著抑制肿瘤生长和抗肿瘤转移的作用。这些结果提示通过进一步的研究有望从这些共用反应基因中发现一些新药靶。此外，以共用反应基因为基础制成芯片，可以建立针对基因群的多靶标高效筛药和评价模型。 综上所述，应用基因芯片技术和多个细胞毒抗肿瘤药物寻找得到的共同反应基因对于阐明抗肿瘤药物作用机制和发现新药靶具有重要的意义。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前 言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

1.细胞增殖实验

2.细胞形态观察

3.细胞凋亡和细胞周期检测

4.基因表达谱芯片检测

5.实时定量PCR

6.药物共用基因及细胞内通路分析

实验结果

一、抗肿瘤药物对白血病HL-60和肝癌QGY7703细胞表型的影响

二、抗肿瘤药物对白血病HL-60和肝癌QGY7703细胞基因表达谱概述

三、抗肿瘤药物基因作用通路分析

四、抗肿瘤药物共同反应基因分析

五、实时定量PCR对芯片结果的验证

讨论

小结

参考文献

致 谢

文献综述 基因芯片在抗肿瘤药物研究中的应用

附录

发表论文1

发表论文2