Irf1基因在伴有高血压的糖尿病大鼠大血管病变VSMC增殖中的作用

摘要

研究Irfl基因高表达对高糖条件培养下的伴有高血压大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响，探讨Irfl基因在伴有高血压的糖尿病大鼠大血管病变VSMC增殖中的作用及机制，对于糖尿病血管并发症的防治具有重要意义。本研究采用体外培养SHR和SD大鼠的VSMC的技术，建立了Irfl基因的高表达模型。运用PCR等方法克隆Irfl基因的编码序列，成功构建了pcDNA3.1-Irfl的真核表达载体。通过绘制转染后的VSMC生长曲线、MTT比色法、PCNA免疫细胞化学检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期的改变，发现Irfl基因增强了DNA的合成并且加速了VSMC细胞周期的进程，对VSMC的增殖有明显的促进作用。结合我室前期工作，初步证明了Irfl基因在伴有高血压的糖尿病大鼠大血管病变VSMC增殖中起重要的作用。 目的：研究Irfl基因高表达对高糖条件培养下的SHR VSMC增殖的影响，探讨Irfl基因在伴有高血压的糖尿病大鼠大血管病变VSMC增殖中的作用及机制。 材料与方法：①体外采用植块法培养SHR和SD大鼠的VSMC，并利用免疫荧光细胞化学的方法鉴定，建立后续研究的细胞模型。②采用PCR等方法克隆Irfl基因的编码序列，并在此基础上将该序列连接到pcDNA3.1质粒中，构建pcDNA3.1-Irfl的真核表达载体，为后续高表达细胞模型的建立及其在VSMC增殖中的作用研究奠定基础。③以SHR转染pcDNA3.1-NON组为对照，将DcDNA3.1-Irfl转染入SHR和SD大鼠的VSMC中，高糖培养，建立Irfl基因高表达细胞模型。通过绘制转染后的VSMC生长曲线、MTT比色法、PCNA免疫细胞化学检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期的改变。 结果：①体外获得纯度较高的SHR和SD大鼠的VSMC，免疫细胞化学鉴定a-actin阳性，细胞经过冻存后可以成功的复苏，细胞活力未受明显影响。②从大鼠肝脏中提取了完整的总RNA，并利用了PCR的方法正确扩增出了Irfl基因的蛋白编码序列片断。在此基础之上，将扩增出的基因连接到了pcDNA3.1真核表达载体中，成功构建了pcDNA3.1-Irfl的真核表达载体。对构建成功的真核表达载体进行PCR鉴定，结果片断长短与预期一致。最后对构建好的真核表达载体进行测序鉴定，测序结果与预期序列100％相符，序列插入方向正确，根据该测序结果可以判定该质粒为成功构建的pcDNA3.1-Irfl重组质粒。③建立了Irfl基因的高表达模型，转染后VSMC增殖能力呈明显上升趋势；PCNA免疫细胞化学检测显示Irfl基因转染后(SHR、SD大鼠)细胞PCNA表达高于SHR转染pcDNA3.1-NON组(p<0.05)。生长曲线显示Irfl基因转染后VSMC生长扩增明显高于SHR转染空白质粒组。MTT比色法显示，Irfl转染组(SHR VSMC、SD VSMC)活细胞数量显著高于pcDNA3.1-NON组(P<0.01)。在流式细胞仪检测中我们发现，转染Irfl的VSMC细胞周期发生明显的改变，SHR转染Irfl基因组VSMC居于DNA合成期(S期)的细胞数量明显高于SD大鼠转染Irfl基因组和SHR转染pcDNA3.1-NON组(P<0.001)。SHR转染pc：DNA3.1-Irfl组的S期细胞数量多，表明该基因增强了DNA的合成并且加速了VSMC细胞周期的进程，对细胞的增殖有明显的作用。 结论：①SHR和SD大鼠的原代培养成功，可以传代扩增和冻存复苏，并且鉴定为高纯度的平滑肌细胞。②成功构建了pcDNA3.1-Irfl的真核表达载体。③Irfl基因在伴有高血压的糖尿病大鼠大血管病变VSMC增殖中起重要的作用。

目录

论文说明：英文缩写表

声明

摘要

详细中文摘要

详细英文摘要

前言

第一部分平滑肌细胞的体外培养及鉴定

前言

1.材料

1.1材料

1.2设备

1.3主要用液配方

1.4实验动物

2.方法

2.1VSMC原代培养及鉴定

3.结果

3.1VSMC原代培养

3.2 SHR VSMC传代培养

3.3 SHR的VSMC鉴定

3.4VSMC复苏的结果

4.讨论

参考文献

第二部分PCDNA3.1-Irf1表达载体的构建

前言

材料和方法

1主要材料及仪器

2方法和步骤

3.实验结果

3.1引物合成

3.2总RNA提取

3.3质粒信息、质粒及PCR产物酶切电泳图谱

3.4 PCR鉴定所构建PCDNA3.1-Irf1质粒

3.5阳性克隆测序结果及分析

4.讨论

参考文献

第三部分Irf1基因高表达对VSMC增殖的影响

前言

1.材料

1.1试剂

1.2设备

2.方法

2.1.细胞转染

2.1.2阳性克隆的筛选

2.1.3阳性克隆的验证(PCR)

2.1.4增殖的检测

2.1.5统计学分析

3.结果

3.1阳性克隆的验证

3.2增殖的检测

4.讨论

参考文献

全文小结

本课题的创新点

本课题下一步的研究工作

致谢

综述 Irfl基因对细胞增殖和凋亡的调控