降糖药艾塞那肽和利拉鲁肽的固相合成及艾塞那肽的药效学评价

摘要

目的:
　　 本题旨在合成多肽类降糖药艾塞那肽和利拉鲁肽，确定一条操作简单可行的固相合成路线;摸索制备型高效液相纯化两种药物的条件并得到纯度为99％以上的多肽;部分药效学实验证明艾塞那肽的刺激胰岛β细胞增殖作用和降糖作用。
　　 方法:
　　 1.合成部分:艾塞那肽和利拉鲁肽合成路线均采用固相合成法，9-芴甲氧羰基(Fmoc)合成策略，分别利用Rink酰氨MBHA树脂(负载量0.23mmol/L)和Fmoc-Gly-Wang树脂(负载量为0.27mmol/L)作为载体、6-氯-1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基碳二亚胺为缩合剂，三氟乙酸为切割试剂。中间过程采用茚三酮检测鉴定是否反应完全。采用半制备型高效液相进行纯化，色谱柱为安捷伦ZORBAXSB-C18型半制备色谱柱(9.4*250mm)，流速4mL/min;波长220nm;进样量每次1mL;流动相A:水(含0.1％TFA);流动相B:乙腈(含0.1％TFA)，摸索纯化条件收集产物峰冷冻干燥。高效液相法测定其含量，质谱鉴定产物分子量。
　　 2.艾塞那肽的部分药效学实验:采用MTT法检测其对大鼠胰岛(INS-1)细胞的增殖活性作用，分别在不同浓度的本实验室制备得艾塞那肽和对照品(礼来公司的艾塞那肽注射液)干预下培养INS-1细胞，测定吸光度值看是否刺激细胞增殖，计算增殖率及ED50以对比两种药物活性是否相当。腹腔注射链佐霉素诱导小鼠糖尿病模型，成模后分为四组:(1)空白组;(2)糖尿病模型组;(3)礼来公司艾塞那肽注射液组;(4)本实验室制备艾塞那肽组。用药15d期间间隔测量血糖观察其降血糖作用。停药1周后，禁食不禁水16小时进行葡萄糖耐量试验。
　　 结果:
　　 1.合成部分:得到明确的合成路线及纯化条件，艾塞那肽洗脱梯度为:初始梯度A占90％，A的比例在15min内降到67％，然后在50min内由67％降到58％，最后在5min内降到0％并保持10min。产物峰在25min左右出现。利拉鲁肽洗脱梯度为:初始梯度A占85％，A的比例在5min内降到70％，然后在25min内由70％降到50％，保持50％10min，最后在10min内降到0％并保持10min。利拉鲁肽的产物峰在33min左右出现。收集到的产物峰冷冻干燥最终得艾塞那肽纯品51.5mg，收率为12.3％，归一化法计算纯度为99.73％。利拉鲁肽制得纯品39.4mg，收率为10.5％。归一化法计算纯度为93.5％。经质谱鉴定艾塞那肽分子量为4186，利拉鲁肽为3751，与实际分子量相符。
　　 2.艾塞那肽的部分药效学实验:艾塞那肽可以刺激胰岛细胞的增殖活性，在浓度为120nmol/L时对细胞的增殖作用最强;本实验室合成的艾塞那肽与对照品艾塞那肽注射液活性相当;连续注射艾塞那肽后，样品组与对照组小鼠血糖明显低于糖尿病模型组(P＜0.05)，样品组与对照组之间差异无统计意义;糖耐量实验结果表明艾塞那肽能明显改善糖尿病小鼠的糖耐量曲线。
　　 结论:
　　 本实验设计的两条路线操作简单、试剂单一、成本较低，可以用来少量合成艾塞那肽和利拉鲁肽。纯化及含量测定方法简便、准确、可重复性高，得到了纯度较高的药物。药效学实验证明艾塞那肽可以刺激胰岛细胞的增殖及降低糖尿病小鼠的血糖。

目录

摘要

符号说明

前言

第一章 艾塞那肽的合成、纯化及鉴定

材料与方法

结果

讨论

第二章 利拉鲁肽的合成、纯化及鉴定

材料与方法

结果

讨论

第三章 艾塞那肽体外细胞活性和体内降血糖实验

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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