抗CD20四价基因工程抗体的构建及抗肿瘤作用研究

摘要

本研究分为四个部分： 第一部分：构建C288的四价抗体。 制备四价抗体的方法有两种，一种是利用化学交联的方法制备二聚体，另一种则是用基因工程的方法构建。化学交联法产生的同型二聚体由于其分子量过大(约300kDa)，免疫原性高，制备困难等缺陷难以应用于临床治疗，故采用基因工程的方法来构建四价抗体。单链抗体的两个结构域可以有两种不同的排列方式，即重链可变区(VH)在前和轻链可变区(VL)在前，且不同的形式可能会影响抗体的亲和力和功能活性。因此在本课题中，设计合成了这两种不同结构域排列方式的C288四价抗体，即分别是轻链可变区(VL)在前(R(ScFvLH)<,4>-Fc)和重链可变区(VH)在前(R(ScFvHL)<,4>-Fc)的两个单链抗体串联于重链恒定区的Fc段上。我们根据C288序列特点设计引物，并在其中引入HindⅢ，NheⅠ和EcoRⅠ酶切位点，运用PCR等分子生物学技术，连接两个单链抗体与人IgG-Fc段至真核表达载体pcDNA3.1(+)。 第二部分：四价抗体的表达、筛选和纯化。 首先，将构建成功的表达载体质粒以脂质体法瞬时转染CHO-K1细胞，用Western-blotting检测表达情况和分子量，流式细胞术检测其与CD20阳性细胞的结合活性。在分子量及功能正确的基础上，再构建稳定表达的CHO细胞株，采用培养上清检测表达后，挑选阳性克隆，扩大培养并收集上清。采用Protein-A柱进行亲和层析纯化目的抗体，SDS-PAGE检测表明纯化后抗体纯度达到95％，Western-blotting进一步确定它们的分子量与理论值吻合，均为180KDa，说明我们构建的四价基因工程抗体的结构完全正确。 第三部分：四价抗体的生物学活性研究。 采用竞争抑制实验、补体介导的细胞毒实验(CDC)、抗体依赖细胞介导的细胞杀伤实验(ADCC)和凋亡实验对四价抗体和C288抗体的体外生物学功能进行比较分析。结果如下： (1)两种结构的四价抗体均可与C288抗体互相竞争抑制与CD20阳性细胞的结合，它们的IC<,50>值分别是：IC<,50>(C288)=9.9±0.9μg/ml，IC<,50>(R(SeFvLH)<,4>-Fc)=5.2±0.5μg/ml，IC<,50>(R(ScFvHL)<,4>-Fc)=2.0±0.2μg/ml。IC<,50>值越低，说明抗体的亲和力越强。 (2)CDC实验结果不仅在B淋巴瘤细胞系中被证明，更是在人工构建的一组不同CD20表达量的CHO细胞中得到证实。结果表明，四价抗体的CDC作用明显高于C288抗体。对于高表达CD20分子的细胞株Daudi和CHO-CD20++++，四价抗体和C288抗体所产生的CDC杀伤作用都很强，从10μg/ml到0.016μg/ml，它们的杀伤能力从90％到25％，在每个点上的杀伤能力都没有明显差异(p>0.05)；对于CD20中等表达量的细胞株Raji、CHO-CD20+++和CHO-CD20++，四价抗体和C288抗体的差别开始显现出来，如在CHO-CD20+++细胞中，在抗体浓度为10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml和0.016μg/ml时，C288的杀伤率分别为35.1％、32.3％、23.1％、14.3％和9.7％，而四价抗体R(ScFvLH)<,4>-Fe和R(ScFvHL)<,4>-Fc的杀伤活性则有明显增强：它们的杀伤率分别各为50.2％、45.2％、33.3％、22.5％、9.9％和58.0％、52.5％、36.6％、23.1％、10.1％，不仅与C288抗体各有显著性差异(p<0.05)，而且两种四价抗体之间也有统计学差异(R(ScFvHL)<,4>-Fe抗体强于R(ScFvLH)<,4>-Fc抗体，p<0.05)：对于CD20低表达的Namalwa和CHO-CD20<'+>细胞，C288抗体几乎没有CDC作用，而四价抗体R(ScFvLH)<,4>-Fc和R(ScFvHL)<,4>-Fc则体现出了一定的杀伤活性：R(ScFvLH)<,4>-Fc抗体在10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml和0.016μg/ml浓度时的杀伤强度分别为7.1％、5.9％、4.8％、3.4％和2.3％；而R(ScFvHL)<,4>-Fe抗体在10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml和0.016μg/ml浓度时的杀伤强度则分别为8.1％、7.2％、5.2％、3.3％和2.3％；两者与C288抗体相比都有明显差异(p<0.01)，且两者之间也有差别(R(ScFvHL)<,4>-Fc强于R(ScFvLH)<,4>-Fc，p<0.05)。 (3)ADCC实验结果表明，在CHO-CD20高、中、低、极低这四群细胞中，四价抗体与C288抗体的ADCC作用相似，它们在10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml和0.016μg/ml时杀伤的细胞百分比分别为约25％、16％、10％和5％，而且表达不同CD20分子数的CHO细胞对抗体介导的ADCC作用的敏感度相似，没有明显差别。 (4)凋亡实验结果表明，四价抗体诱导B淋巴瘤细胞和转染CD20的CHO细胞的凋亡作用明显强于C288抗体，其中尤以R(ScFvHL)<,4>-Fc的作用最强，它可以诱导31.95％CHO-CD20+++细胞的凋亡，而C288抗体只能诱导6.45％这部分细胞的凋亡。但表达不同CD20分子数的肿瘤细胞对抗体诱导的凋亡作用的敏感度相似，没有明显差别。 (5)为了对机理进行进一步的探讨，对抗体和C1q、Fc受体的结合，抗体在CD20阳性细胞上的解离速度进行了检测。结果发现，不同结构的四价抗体在与C1q的结合能力上均强于C288抗体，而在与U937细胞(CD20阴性、Fc受体阳性)的结合能力上则是相同的。最重要的是，通过解离速率的实验我们发现，四价抗体结合到细胞上以后，他们解离的速度明显低于C288抗体。在4h时，C288抗体只剩余0min时的62％，而R(ScFvLH)<,4>-Fc和R(ScFvHL)<,4>-Fc则仍剩余原来的80％(p<0.05)；与之相对应时间点的CDC实验也证实，当C288抗体的CDC功能仅为0min时的52％小于，R(ScFvLH)<,4>-Fc和R(ScFvHL)<,4>-Fc的CDC功能仍维持为原来的80％(p<0.05)。 (6)在CD20阳性细胞于人全血环境中的体外清除实验中我们则发现，C288抗体能清除在人全血环境中的CD20高表达的肿瘤细胞和CHO细胞，但它不能有效清除CD20低表达的肿瘤细胞和CHO细胞，而四价抗体不仅能有效清除CD20高表达的肿瘤细胞和CHO细胞，还能清除CD20低表达的肿瘤细胞和CHO细胞，其中又以R(ScFvHL)<,4>-Fc抗体的清除作用最强，两种四价抗体之间的差别具有统计学意义。 两种抗体发生竞争抑制的原因主要有两个：一是它们识别同一抗原位点：二是两种抗体的识别位点在空间上靠近，因存在空间位阻而发生竞争抑制。构建的两种结构的四价抗体R(ScFvLH)<,4>-Fc和R(ScFvHL)<,4>-Fc均为C288的可变区结构，高浓度的两种抗体可以完全抑制C288抗体与CD20阳性细胞的结合，这表明它们与C288识别的是同一抗原位点。四价抗体的CDC作用较C288抗体明显增强，这是因为它们的解离率低。它们从CD20阳性细胞上解离的慢，所以在相同单位时间内，它们可以在局部招募到更多的C1q，从而发挥更强的CDC作用。 第四部分：四价抗体的动物体内药代动力学研究。 已经在体外证明，构建的四价基因工程抗体比C288抗体具有更强的抗肿瘤作用，为下一步的临床应用提供了实验依据。然而，在进行临床研究之前，还应检测抗体在体内的半衰期，即抗体的动物体内药代动力学实验。实验在ICR小鼠体内进行，抗体以50μg/只的剂量进行尾静脉注射，每隔一天取眼眶血，流式细胞术荧光竞争法检测血浆中各抗体的浓度，连续取40天。结果表明，四价抗体R(ScFvLH)<,4>-Fc和R(ScFvHL)<,4>-Fc在小鼠体内的半衰期分别为119.5h和153.9h，二者相对于C288抗体的半衰期(109.3h)各有统计学意义，且两者之间也有显著差别(p<0.05)。该结果表明，构建的四价基因工程抗体在小鼠体内具有十分稳定的分子结构。 综上所述，本课题构建的四价基因工程抗体具有十分稳定的结构和显著降低的解离速率，与C288抗体相比，其对CD20阳性肿瘤细胞特别是CD20低度表达肿瘤细胞的CDC作用可明显增强，从而可在体外有效清除对C288抗体不敏感的低表达CD20分子的肿瘤细胞。同时，本研究也证实，两种结构的四价抗体在CDC作用、凋亡作用及清除作用上均有显著性差异，VH在前的结构明显优于VL在前的结构。本课题的研究有望为对C288不敏感的低表达CD20分子的B淋巴瘤的治疗提供新型抗体药物。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

中文详细摘要

英文详细摘要

前言

第一部分抗CD20四价基因工程抗体序列的克隆及相关载体的构建

实验一抗CD20四价基因工程抗体基因序列的克隆

材料和方法

结果

实验二抗CD20四价基因工程抗体真核表达载体的构建

材料和方法

结果

讨论

第二部分抗CD20四价基因工程抗体的CHO细胞表达及纯化

实验一表达抗CD20四价基因工程抗体的CHO细胞克隆的筛选及鉴定

材料和方法

结果

实验二抗CD20四价基因工程抗体的纯化

材料和方法

结果

讨论

第三部分抗CD20四价基因工程抗体的体外生物学功能研究

实验一抗CD20四价基因工程抗体体外结合活性及竞争活性的鉴定

材料和方法

结果

实验二抗CD20四价基因工程抗体补体介导细胞溶解作用及解离率的检测

材料和方法

结果

实验三抗CD20四价基因工程抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒作用及促凋亡作用的检测

材料和方法

结果

实验四抗CD20四价基因工程抗体体外人全血环境中对CD20阳性细胞的清除作用

材料和方法

结果

讨论

第四部分抗CD20四价基因工程抗体的动物体内药代动力学研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

论文小结

综述基因工程抗体的研究进展

致谢